Estudo ultraestrutural da interação de amostras de Escherichia coli enteroagregativa (AEAC) com mucosa intestinal humana preservada "in vitro": sugestão de invasão como fator de virulência

Jacy Alves Braga de Andrade

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Medicina.

Este trabalho foi desenvolvido na Disciplina de Gastroenterologia Pediátrica do Departamento de Pediatria da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina e no Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal de São Paulo/ Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), com o auxílio financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

RESUMO

Diarréia persistente é definida como um episódio de diarréia de etiologia presumivelmente infecciosa, que se inicia agudamente e que persiste de forma não usual por mais de duas semanas, acarretando agravo do estado nutricional e alto risco de vida. Amostras de Escherichia coli enteroagregativa tem sido associadas a diarréia persistente em diversos países em desenvolvimento e são identificadas por sua habilidade em produzir padrão de aderência agregativo (AA) na superfície de células HEp-2 e HeLa. Vários modelos tem sido empregados no estudo destas bactérias e de sua patogenicidade. Alguns autores tem empregado modelos “in vivo”, com alças intestinais de ratos, coellhos e suínos gnotobióticos. Outros tem aplicado testes “in vitro” com linhagens celulares, tais como: Caco2, T84, HT29, HeLa e HEp-2 e com cultura de orgão "in vitro" (IVOC), utilizando fragmentos de biópsia intestinal. Vários fatores de virulência tem sido identificados nestas bactérias. Os dados disponíveis não permitem o completo entendimento da patogênese das EAEC, ainda que várias hipóteses tenham sido sugeridas. Como se sabe que na diarréia persistente, são necessárias alterações no intestino delgado, afim de justificar a patogênese do processo, mais estudos mostrando as interações de EAEC com mucosa intestinal são desejáveis. Este estudo avaliou interações de amostras de EAEC, usando cultura de orgão "in vitro", afim de observar e comparar alterações em diferentes regiões do trato digestivo (intestino delgado distal e intestino grosso). Amostras de EAEC foram isoladas das fezes de crianças com diarréia persistente e uma amostra foi isolada das fezes de uma criança sem diarréia. As cepas selvagens foram coletadas de crianças menores de seis meses de idade com diarréia persistente, hospitalizadas em São Paulo-Brasil. A amostra protótipo 042 (O44:H18) isolada de uma criança com diarréia em Lima, no Peru foi incluida como controle positivo. Culturas bacterianas das amostras de EAEC mantidas em ágar nutriente foram inoculadas em caldo triptona de soja (TSB) e incubadas em estufa a 37º C por 18 horas. Neste estudo, foram utilizados íleo terminal e cólon de pacientes pediátricos. Biópsias de íleo e cólon foram também obtidas, em colonoscopias realizadas em pacientes adultos, de áreas sem anormalidades macroscópicas aparentes. Os fragmentos intestinais infectados "in vitro" foram então fixados em solução tamponada de paraformaldeído (PFA) para avaliação em microscopia de luz (ML) e em Karnovsky modificado (Km) para avaliação em microscopia eletrônica de transmissão (MET) e de varredura (MEV). Cada bactéria foi testada em triplicata para cada região avaliada. A análise por MEV mostrou agregados bacterianos em pilhas de tijolos firmemente aderidas a espessa camada de muco e também diretamente sobre o epitélio. Cepas diferentes mostraram aderir a ambas as regiões do trato digestivo da mesma maneira, especialmente as amostras selvagens e a protótipo. Quantificação bacteriana não foi realizada, mas a cepa RN 190/2 também formou agregados bacterianos aderidos à camada de muco. As bactérias revelaram estruturas longas em sua superfície que parecem mediar a adesão ao muco, ao epitélio e às outras bactérias. A análise por ML e por MET indicou associação de amostras de EAEC com o epitélio provocando alterações. Estas bactérias aderiram a ambas as regiões avaliadas: intestino delgado distal e grosso. As cepas pareceram usar mecanismos diferentes para produzir lesão nos intestinos, confirmando a heterogeneidade destes agentes. Amostras de EAEC aparentemente causaram alterações, especialmente naquelas áreas aonde estavam diretamente interagindo com o epitélio. No íleo, algumas regiões mostraram internalização secundária. Sugestão de invasão pelas cepas 071-1 e 042 foi demonstrada em ambos os sítios avaliados. A patogênese da diarréia persistente deve incluir alterações no intestino delgado aonde ocorrem as funções digestivo-absortivas. As alterações encontradas pareceram mais intensas no íleo que no cólon, e sugestão de invasão afigurou-se como outro fator de virulência.

ABSTRACT

Persistent diarrhea is an episode, presumably from an infectious origin, that begins acutely and lasts more than 14 days, potentially giving rise to malnutrition and high risk of death. Enteroaggregative Escherichia coli have been associated with persistent diarrhea in several developing countries and are identified by their ability to produce an aggregative pattern of adherence (AA) to HEp-2 and HeLa cell surfaces. Several models have been applyed to study these bacteria and their patogenicity. Some authors have employed "in vivo" procedures with animal models as rat, rabbit and gnotobiotic piglets intestinal loops. Others have employed "in vitro" assays with cellular lines like T84, Caco 2, HT29, HeLa e HEp-2 and "in vitro"organ culture (IVOC) with intestinal fragments. Several virulence factors have been identified in EAEC. Available data do not permit a complete understanding of EAEC pathogenesis, yet several hypothesis have been formulated. As we know that in persistent diarrhea, it is necessary to have alterations in small intestines to justify the pathogenesis of the process, more investigations showing interactions of EAEC with intestinal mucosa are desirable. This study examined interactions of EAEC strains, using “in vitro” organ cultures, in order to observe and compare alterations in different regions of both, small and large intestinal mucosa. EAEC strains were isolated from stools of infants with persistent diarrhea and one, from stools of an infant without diarrhea. The wild strains were collected from children below 6 months of age with persistent diarrhea, that were hospitalized in São Paulo - Brasil. Prototype strain 042 (O44:H18) isolated from a child with diarrhea in Lima, Peru was included as positive control. Strains stored at room temperature in nutrient agar were grown on tryptic soy broth (TSB) for 18 hours at 37°C. Intestinal mucosa used in this study were from terminal ileum and colon excised from pediatric patients. Ileal and colonic biopsies were also taken from adult patients undergoing colonoscopy in areas that showed macroscopically no abnormalities. Intestinal fragments were fixed in paraformaldehyde (PF) for light microscopic (LM) evaluation and in modified Karnovsky (mK) (paraformaldehyde-glutaraldehyde solution) for scanning and transmission eletron microscopic study (SEM and TEM). Each bacteria was tested with three intestinal fragments for each region. SEM analysis showed typical aggregates in “stacked brick“ pattern firmly adhered in a gross layer of mucus and also to the epithelium. Different strains seemed to adhere in similar way, to both: ileum and colon, specially the wild strains and the prototype. Bacterial quantification was not performed, but RN 190/2 also formed bacterial aggregates and a similar layer of mucus with bacteria firmly adhered to it was found. Long fimbrial structures of bacterial surface, that seem to mediate the adhesion were demonstrated. LM and TEM analysis suggested an association of EAEC strains with the epithelium, giving rise to alterations. These bacteria adhered to both, small and large bowel mucosa. Different mechanisms were employed to produce lesions in the intestines, confirming the heterogeneity of these agents. EAEC strains seemed to cause alterations, specially in those areas where they were directly interacting with the epithelium. In ileum, some areas showed secundary internalization. Strains 042 and 171-1 showed suggestion of invasion in both evaluated regions. The pathogenesis of persistent diarrhea should include alterations in the small intestinal structures where the digestive-absorptive functions take place. The aterations that were found seemed to be more intense in ileum than in colon, and suggestion of invasion appeared to be another virulence factor.

1.  INTRODUÇÃO

A Organização Mundial de Saúde (OMS) define diarréia persistente como o episódio de diarréia de etiologia presumivelmente infecciosa, que se inicia agudamente e que persiste de forma não usual por mais de duas semanas (WHO, 1988), acarretando agravo do estado nutricional e alto risco de vida. Diarréia persistente é responsável por altas taxas de morbidade e mortalidade em lactentes de baixo nível sócio-econômico em países em desenvolvimento (WHO,1988; 1992; 1996), aparecendo como causa e efeito da desnutrição e aumentando o risco de morte quando associada a esta (BHANDARI e cols., 1992, FAUVEAU e cols, 1992).

Estima-se que de 3 a 20% dos episódios de diarréia aguda em crianças menores de cinco anos tornam-se persistentes e que, das mortes provocadas por diarréia, 50% ou mais estejam associadas a episódios persistentes (VICTORA e cols, 1992; FAUVEAU e cols., 1992; MBORI-NGACHA e cols., 1995). Ainda observa-se que, em regiões de baixa renda no Brasil, diarréia persistente apresenta alta prevalência, chegando a níveis superiores a 50%. LINS & SILVA (2000) mostraram que de 246 crianças menores de 2 anos avaliadas por doença diarréica em Recife, nordeste do Brasil, 56,9% evoluiram por mais de 2 semanas.

1.1. FISIOPATOLOGIA

Sabe-se que são múltiplos e complexos os mecanismos fisiopatológicos que podem estar presentes e que determinam a perpetuação do processo diarréico (BLACK, 1993). A diarréia pode tornar-se persistente por uma lesão prolongada das vilosidades intestinais e por uma dificuldade em restaurá-las. A grande maioria dos pacientes com diarréia persistente teve como início um episódio de diarréia aguda (FAGUNDES-NETO e cols., 1984A) e sabe-se, que alguns fatores decorrentes da diarréia aguda, tais como: desnutrição (LIMA & GUERRANT, 1992), ação direta de enteropatógenos sobre os enterócitos (FAGUNDES-NETO e cols., 1997) e alergia alimentar (WALKER-SMITH, 1984) podem propiciar a instalação da diarréia persistente.

Os enteropatógenos, de acordo com seus mecanismos de virulência, provocam lesões na mucosa intestinal, e assim, o estado da barreira mucosa e a capacidade do hospedeiro em defender-se podem influenciar a vulnerabilidade à persistência destas lesões. Desta forma, na vigência do processo diarréico, ocorre agressão à mucosa e a bordadura estriada do enterócito, alterando sua morfologia (FAGUNDES NETO e cols., 1979; WHO, 1988).

A alteração na borda em escova dos enterócitos com descamação da célula epitelial madura provoca deficiências enzimáticas e consequentemente má absorção dos carbohidratos da dieta. A lesão da mucosa do intestino delgado altera a barreira de permeabilidade favorecendo a passagem de proteínas alimentares, não ou parcialmente hidrolisadas através da mucosa, podendo levar a alergia às proteínas da dieta (leite de vaca, soja e outras) (HALPIN e cols.,1977; GOEL e cols.,1978). Além disso, devido a algum grau de incapacidade por parte do hospedeiro em manter eficazes os mecanismos que regulam a flora bacteriana, pode ocorrer sobrecrescimento bacteriano nas porções superiores do intestino delgado (CHALLACOMBE e cols., 1974; FAGUNDES NETO e cols.,1976; HILL e cols., 1983; CRUZ,1996). Como consequência direta desta alteração da microecologia do intestino delgado, uma série de eventos patológicos passam a ocorrer em cadeia, tais como: desconjugação e 7(-desidroxilação dos sais biliares (AMENT e cols.,1972), alterações morfológicas da mucosa intestinal (GIANELLA e cols.,1974; GREENE e cols.,1975; FAGUNDES NETO e cols.,1984B) provocando diminuição da superfície de absorção (KLISH e cols.,1978) e lesões funcionais com deficiência de enteroquinase (LEBENTHAL e cols.,1975) e da enzima (Na+K+) ATPase (FAGUNDES NETO e cols.,1981A). Os sais biliares desconjugados e 7(-desidroxilados são capazes de provocar alterações na barreira de permeabilidade da mucosa intestinal (BALISTRERI e cols.,1977; FAGUNDES NETO e cols.,1981B). Por outro lado, disfunção do íleo terminal tem sido descrita (GRACEY,1971) em pacientes com diarréia persistente e desnutrição, levando não somente à deficiência de vitamina B12, mas também à reabsorção inadequada dos sais biliares. A consequente diminuição do pool de sais biliares acarreta má absorção das gorduras da dieta (KING e cols.,1979) tendo como resultado esteatorréia e privando o paciente de receber importante oferta calórica. Além disso, a excreção de sais biliares induz ao aparecimento de diarréia colerética, por ação tóxica direta dos sais biliares sobre a mucosa colônica (TEICHBERG e cols.,1981).

Outro fator perpetuador do processo diarréico é a dificuldade de recuperação da mucosa intestinal. O maior determinante desta ocorrência é a presença de desnutrição energético-protéica além de deficiências específicas de micronutrientes, que determinam anormalidades na estrutura e na função do intestino delgado (WHO,1989).

Em decorrência desta série de eventos, várias alterações morfológicas tem sido descritas na mucosa intestinal de pacientes com diarréia persistente. Por microscopia de luz (ML), diferentes graus de atrofia vilositária, incluindo atrofia sub-total com aumento do infiltrado inflamatório tem sido demonstrados (SULLIVAN & MARSH, 1992). Também por ML, outros autores confirmaram que pacientes com diarréia persistente apresentam alterações importantes da mucosa do intestino delgado, sendo que alguns não as associaram a enteropatógenos específicos (SHINER e cols., 1990A), enquanto que outros associaram as lesões observadas em pacientes com diarréia, à presença de Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) nas fezes (KALLAS e cols., 1995; FAGUNDES-NETO e cols., 1997). Por outro lado, sabe-se que o quadro clínico na diarréia persistente não está relacionado com a gravidade da lesão histológica (SULLIVAN & MARSH, 1992).

FAGUNDES NETO e cols. (1984B, 1985) avaliando a morfologia da mucosa intestinal de pacientes com diarréia persistente, através de microscopia eletrônica de transmissão (MET), mostraram várias alterações estruturais, em especial o achatamento das microvilosidades, além de número aumentado de corpos multivesiculares e vacuolização das mitocôndrias e do retículo endoplasmático. SHINER e cols. (1990B), avaliando mucosa intestinal de pacientes com diarréia persistente, através de MET, demonstraram aumento da espessura da lâmina basal dos enterócitos e do endotélio dos vasos, assim como depósito de colágeno na lâmina própria, alterações estas, que pareceram estar relacionadas à presença de bactérias aderentes e não aderentes. Por microscopia eletrônica de varredura (MEV), outro estudo demonstrou a presença de lesões intensas e inespecíficas em relação ao agente enteropatogênico, tais como: diminuição do número e tamanho das microvilosidades, desarranjo estrutural dos enterócitos e em metade dos casos, presença de material mucoso recobrindo parte do epitélio (COSTA e cols., 1997; FAGUNDES-NETO e cols., 2000).

1.2. ETIOLOGIA

Estudos tem demonstrado ser comum a excreção de patógenos nas fezes de crianças com diarréia persistente, com taxas de isolamento superiores a 40%. BRAGA DE ANDRADE e cols. (1998) obtiveram 57,1% de positividade na pesquisa etiológica realizada em pacientes com diarréia persistente em São Paulo, Brasil. A excreção de patógenos nas fezes de crianças assintomáticas, em países em desenvolvimento é comum, o que dificulta a interpretação dos resultados dos estudos epidemiológicos.

No Brasil, os agentes mais frequentemente isolados nas fezes de crianças com diarréia persistente, tem sido: Escherichia coli enteropatogênica (EPEC), Salmonella e Shigella (BRAGA DE ANDRADE e cols., 1998; FAGUNDES-NETO e cols., 1988; FAGUNDES-NETO e cols., 1990; MOSTAÇO e cols., 1987). Outros autores, também no Brasil, tem associado Escherichia coli enteroagregativa (EAEC) e Cryptosporidium a episódios persistentes de diarréia (FANG e cols.,1995; LIMA e cols., 1992).

No Ceará, WANKE e cols. (1991) isolaram EAEC mais frequentemente em fezes de crianças com diarréia persistente, que em diarréia aguda ou controles. Resultados similares tem sido encontrados em outros países em desenvolvimento (BARDHAN e cols., 1998; BHAN e cols., 1989A, BHAN e cols., 1989B, BHAN e cols., 1989C; BHAN e cols., 1989D; BHATNAGAR e cols., 1993; BHATNAGAR e cols., 1996; CRAVIOTO e cols., 1991; FANG e cols., 1995; HENRY e cols., 1992).

1.3. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)

Por definição, EAEC é um grupo de bactérias que abrange sorogrupos de E. coli que aderem a linhagens celulares "in vitro", tais como células HeLa e HEp-2 formando agregados bacterianos, localizados na superfície celular e em regiões da lamínula livres de células, em arranjo semelhante a tijolos empilhados (aderência agregativa) (NATARO e cols., 1987). A configuração em “pilha de tijolos” é considerada condição obrigatória para o padrão típico de aderência agregativa (AA) (NATARO, 1995).

Amostras de E. coli apresentando variações no padrão AA tem sido esporadicamente relatadas após a descrição do padrão AA típico (KNUTTON e cols, 1992; NATARO e cols.; 1995). Durante estudos epidemiológicos conduzidos na Disciplina de Microbiologia da Universidade Federal de São Paulo/Escola Paulista de Medicina (UNIFESP/EPM), em colaboração com Centers for Disease Control and Prevention (CDC) de Atlanta, Ga, foram identificadas algumas amostras que apresentavam variação no padrão AA. Estas variantes incluiam amostras com distribuição predominante de bactérias na lamínula (AAL), amostras que apresentavam AA ou AAL mas que não hibridavam com a sonda AA, amostras que hibridavam com a sonda AA, porém promoviam destacamento da monocamada celular (GOMES e cols., 1998). A maioria dos estudos de virulência da categoria EAEC analisa amostras que produzem o padrão típico e reagem com a sonda EAEC, embora alguns poucos trabalhos tenham analisado algumas amostras variantes em conjunto com amostras típicas. Uma vez que esta categoria tem se mostrado bastante heterogênea, em vários aspectos genotípicos e fenotípicos, não se sabe se esta diversidade ocorre em cada tipo de variante ou se ela pode ser atribuida ao fato de se realizar uma análise conjunta da patogenicidade de amostras típicas e variantes (SUZART, 2000). Este grupo de bactérias apresenta tanto cepas patogênicas quanto não patogênicas.

HAIDER e cols. (1991) mostraram associação de EAEC com 15% dos episódios diarréicos em crianças menores de 1 ano de idade, em Bangladesh. Destes episódios, 10% tornaram-se persistentes. No Nordeste do Brasil, LIMA e cols. (1992) observaram alta incidência de E. coli enteroaderente nas fezes e no suco jejunal de crianças com diarréia persistente (36% com aderência agregativa, 29% com aderência difusa e 13% com aderência localizada a células HEp-2). HENRY e cols. (1992), em Bangladesh, publicaram estudo em que isolaram EAEC nas fezes de 27,4% dos casos de diarréia que persistiram por mais de 14 dias e nas fezes de 17,9% dos episódios agudos. BHATNAGAR e cols. (1993), na Índia, estudando 284 crianças menores de 2 anos, com diarréia não sanguinolenta, e 107 controles, encontraram EAEC em 21,4% dos casos de diarréia persistente, em 9,9% dos casos de diarréia aguda e em 3,7% dos controles. BHATNAGAR e cols. (1996) observaram alta excreção de cepas de EAEC no período inicial de diarréia persistente em pacientes hospitalizados em Nova Delhi, encontrando estes agentes em 32% dos casos e em apenas 8% dos controles. Neste estudo, o isolamento de EAEC em diarréia persistente foi significativamente maior que em pacientes com diarréia aguda e controles, e ao mesmo tempo maior em diarréia aguda que em controles, embora não estatisticamente significante. No Brasil, FANG e cols. (1995) revisaram 4800 casos de doença diarréica e selecionaram 56 crianças com diarréia persistente, 52 com diarréia aguda e 42 controles. Neste grupo, cepas de EAEC foram isoladas em 68% dos casos de diarréia persistente, 46% dos casos de diarréia aguda e em 31% dos controles. BARDHAN e cols. (1998) estudaram 195 crianças, das quais, 135 com diarréia persistente, 42 com diarréia aguda e 15 controles. EAEC foi isolada nas fezes de 25,4% das crianças com diarréia persistente. Estes autores também concluiram que EAEC é importante patógeno associado a diarréia persistente.

Outros autores observaram que o padrão AA de aderência foi detectado nos casos de diarréia aguda e persistente com frequência semelhante, não tendo sido observado nos controles (SCALETSKY e cols., 1999). Neste estudo, este agente foi associado à doença diarréica, mas não com maior tendência à diarréia persistente. Estes agentes também tem sido associados à diarréia aguda (COBELJIC e cols., 1996; GONZALEZ e cols., 1997; PAUL e cols., 1994).

HAIDER e cols. (1991) mostraram associação de EAEC com 15% dos episódios diarréicos em crianças menores de 1 ano em Bangladesh. Destes episódios, 10% tornaram-se persistentes. Estas bactérias foram associadas a diarréia secretora e mucóide, sendo que mucóide em 19% dos casos.

Em países desenvolvidos, cepas de EAEC também tem sido relacionadas à doença diarréica aguda e crônica (CHAN e cols., 1994 ; GASCÓN e cols., 1998; HUPPERTZ e cols., 1997; ITOH e cols., 1997; JALLAT e cols., 1993;  SCOTLAND e cols., 1991; SMITH e cols., 1997). CHAN e cols. (1994) na Inglaterra, avaliando amostras fecais de crianças com diarréia, concluiram que estas bactérias parecem estar associadas tanto a episódios agudos quanto a persistentes naquele país. HUPPERTZ e cols. (1997) relataram a associação de diarréia aguda e crônica e dor abdominal em crianças jovens com EAEC na Alemanha. No Japão, ITOH e cols. (1997), estudando uma importante epidemia de doença diarréica, isolaram 27 espécies de EAEC em 12 de 30 pacientes com diarréia persistente, todos com o mesmo sorotipo (ONT:H10). Os autores associaram EAEC à epidemia de doença diarréica naquele país.

Por outro lado, alguns estudos não tem associado EAEC à doença diarréica (ALBERT e cols., 1995; ALBERT e cols., 1999; ECHEVERRIA e cols., 1992; Girón e cols., 1991; GOMES e cols., 1989; GUNZBURG e cols., 1993; ROSA e cols., 1998; VILA e cols., 1998;).

LANATA e cols. (1992) em Lima, no Peru, avaliaram 677 crianças abaixo dos tres anos de idade, durante um período de 27 meses. Foram estudados os enteropatógenos envolvidos em episódios de diarréia aguda, prolongada e persistente. Os autores não encontraram nenhum microorganismo particularmente associado à diarréia persistente e EAEC teve frequência similar nos tres tipos de episódios diarréicos avaliados. BAQUI e cols. (1992) em Bangladesh, realizaram estudo longitudinal com 705 crianças abaixo dos 5 anos de idade, coletando amostras de fezes no início do processo diarréico e nos dias 15–17 da doença quando esta persistiu. Neste estudo, não foi encontrada associação de EAEC com diarréia aguda e persistente. No Chile, LEVINE e cols. (1993), estudando crianças com diarréia, isolaram EAEC na mesma frequência entre crianças com diarréia e em controles. Dos 1081 episódios de diarréia avaliados, 103 foram persistentes e destes, 16,5% estiveram associados à EAEC e dos 96 controles avaliados, EAEC foi isolada em 25% dos casos. Entre os recém-nascidos, um total de 77 dos 662 episódios de diarréia avaliados foram persistentes e destes, 15,6% foram associados com EAEC. No entanto, este agente foi também isolado em 13% dos 77 controles sem diarréia. Portanto, neste estudo, EAEC não esteve significativamente associada a diarréia persistente. Na África, SULLIVAN e cols. (1994) concluiram que EAEC não parecem ser patógenos importantes em diarréia persistente, tendo sido isoladas nas fezes de 5 crianças desnutridas com diarréia persistente e em 5 controles sadios sem diarréia e sem desnutrição.

Alguns estudos com voluntários tem sugerido o papel patogênico destas bactérias. MATHEWSON e cols. (1986) realizaram um estudo em voluntários humanos, que desenvolveram quadro diarréico após terem recebido por via oral, duas cepas de E. coli isoladas das fezes de dois adultos americanos com diarréia após viagem a Guadalajara no México. Uma destas bactérias foi, mais tarde, identificada como EAEC (NATARO e cols., 1987). Posteriormente, quatro cepas de EAEC foram oferecidas a voluntários após neutralização gástrica. Os sintomas gastrointestinais observados se deram após a administração da cepa 042, isolada de crianças portadoras de diarréia em Lima (Peru), o que sugeriu a existência de diferentes mecanismos de virulência entre estas bactérias (NATARO e cols., 1995).

No Brasil, um estudo prospectivo realizado em Fortaleza, Ceará, demonstrou através da determinação de marcadores fecais inflamatórios, como lactoferrina fecal e interleucinas (IL-8 e IL-1(), que estas bactérias provocaram enterite que em crianças está associada a dificuldades para ganho de peso e estatura. Os autores sugeriram que a liberação de procitoquinas inflamatórias pelo epitélio intestinal é parte da fisiopatologia da infecção por EAEC (STEINER e cols., 1998)

Por outro lado, a variabilidade de resultados em estudos epidemiológicos, tem levado alguns autores a questionar a patogenicidade destes agentes (ECHEVERRIA e cols., 1992). Algumas justificativas tem sido dadas, entre elas, este ser um grupo heterogêneo de bactérias no que diz respeito a seus fatores de virulência, e também o fato da capacidade destas bactérias de provocar diarréia parecer estar relacionada com variáveis do hospedeiro (NATARO e cols., 1995, OKEKE e cols., 2000).

Na tentativa de elucidação do mecanismo patogênico das EAEC, o fenômeno de adesão induzido por esta bactéria tem sido estudado. Para tanto, tem sido empregados modelos “in vitro” com linhagens celulares intestinais permanentes, tais como: Caco2, T84, e HT29 (KNUTTON e cols., 1992; NATARO e cols., 1996; NAVARRO-GARCIA e cols., 1999); linhagens celulares de outras origens como HeLa (proveniente de carcinoma de colo uterino) e HEp-2 (proveniente de carcinoma de laringe humana) (CRAVIOTO e cols., 1991; KNUTTON e cols., 1992); fragmentos de biópsia intestinal humana (YAMAMOTO e cols., 1991; KNUTTON e cols., 1992; HICKS e cols. 1996A.; HICKS e cols. 1996B; HICKS e cols. 1996C) e enterócitos isolados (RAJ e cols., 1990). Também foram empregados modelos “in vivo”, com mucosa intestinal de suínos, ratos e coellhos (VIAL e cols., 1988; TICKOO e cols, 1992; TZIPORI e cols., 1992).

1.4. ESTUDOS DE INTERAÇÃO “IN VITRO”

KNUTTON e cols. (1991), estudando adesão de amostras EAEC, isoladas de crianças com diarréia na Índia e no Reino Unido, a fragmentos de mucosa intestinal humana (duodenal, ileal e colônica) “in vitro”, observaram que nenhuma bactéria aderiu à mucosa duodenal, enquanto todas as 44 cepas estudadas aderiram à mucosa colônica. Os autores, pela dificuldade em conseguir fragmentos de intestino humano, não puderam avaliar todas as 44 cepas do estudo com mucosa ileal mas, observaram que 6 cepas que mostraram significativa adesão à mucosa colônica não aderiram à mucosa ileal fornecida por um único doador. As bactérias aderiram em agregados localizados e pareceram não provocar danos à mucosa. A observação por MET demonstrou que a adesão destas amostras de EAEC é mediada por fímbrias. Pesquisa por coloração negativa detectou 4 tipos morfologicamente distintos de fímbrias entre as 44 amostras estudadas.

YAMAMOTO e cols. (1991), estudando uma única amostra de EAEC, observaram que os níveis de aderência à mucosa de intestino delgado humano (jejuno e íleo) pré fixado e não pré fixado foram baixos, apesar de ter sido encontrada adesão a muco, aos folículos linfóides e inclusive, às células M. Por outro lado, foi observada intensa adesão à mucosa colônica pré fixada e à camada de muco sobre o epitélio. Estudo subsequente, avaliando mucosa intestinal humana “in vitro”, revelou que amostras de EAEC, isoladas de crianças com diarréia no México, Chile, Peru e Tailândia, apresentaram baixos níveis de adesão ao intestino delgado (YAMAMOTO e cols., 1992). Estes ensaios concluiram que cepas de EAEC colonizam preferencialmente o intestino grosso.

Mais recentemente, alguns autores demonstraram a aderência destas bactérias a regiões do intestino delgado (HICKS e cols., 1996A ; HICKS e cols. 1996B; HICKS e cols. 1996C; NATARO e cols., 1996), concordando com RAJ e cols.(1990), que avaliando a capacidade de aderência de EAEC a enterócitos isolados, mostraram que 35% das bactérias estudadas aderiram a enterócitos isolados do duodeno de pacientes adultos.

HICKS e cols. (1996A) produzindo infecção experimental, utilizando fragmentos de mucosa intestinal humana pre fixada "in vitro", com amostras de EAEC isoladas de crianças com diarréia do Reino Unido e com a amostra protótipo 221, observaram que cinco das seis cepas avaliadas aderiram preferencialmente à mucosa jejunal, com limitada adesão à mucosa ileal e colônica. A média de bactérias aderidas apresentou variações de cepa para cepa e entre as regiões do trato digestivo avaliadas. Os autores, apesar de terem podido avaliar somente as fases iniciais do processo de interação bacteriana já que o tecido era pre fixado, confirmaram neste estudo, a capacidade destes agentes de aderir tanto à região proximal quanto à distal do trato digestivo de crianças, e sugeriram que a adesão às regiões proximais do trato digestivo poderia ser a causa de efeitos adversos sobre as capacidades digestiva, absortiva e secretória da mucosa intestinal.

Em outro estudo, estas mesmas amostras, além de uma outra protótipo, a 17-2, isolada de crianças chilenas com diarréia persistente, colonizaram várias regiões do trato gastrointestinal (intestinos delgado e grosso) (HICKS e cols., 1996B). Estas bactérias foram submetidas a testes de interação com fragmentos de jejuno, íleo e cólon obtidos de crianças e aderiram a todos eles, em especial ao tecido ileal. As amostras controles aderiram à mucosa jejunal, ileal e colônica, enquanto que as amostras selvagens também aderiram a estas porções do intestino, mas com alguma variabilidade: duas aderiram a todas as regiões avaliadas, uma aderiu ao jejuno e ao íleo, uma somente ao íleo e uma ao íleo e ao cólon. Os autores utilizaram cultura de orgão "in vitro" que permitiu melhor avaliação da interação bacteriana com o tecido. No intestino delgado, a MET revelou bactérias em associação com uma grossa camada de muco sobre a borda em escova intacta. Nesta camada de muco, foram observados restos celulares. Nos fragmentos de cólon foram demonstrados efeitos citotóxicos, com alargamento e abertura das criptas, fendas intercrípticas e vesiculação das microvilosidades, além de extrusão de células epiteliais (HICKS e cols., 1996B).

NATARO e cols. (1996) observaram efeitos citotóxicos produzidos através de infecção experimental com amostras de EAEC (042) a intestino delgado e grosso de crianças e a células T84. À MEV, foram observadas bactérias firmemente aderidas à mucosa nas diversas regiões do intestino avaliadas, além de áreas com desorganização do tecido. Os autores referiram maior afinidade ao cólon que ao intestino delgado. À MET, foram observados: aderência ao cólon, com dilatação e abertura das criptas, aparecimento de fendas intercrípticas e exfoliação de enterócitos. Com exceção de extrusão celular, estes efeitos não foram observados no intestino delgado. Na linhagem celular T84, foram documentados os mesmos efeitos, assim como vesiculação do ápice da borda em escova, em algumas células resultando em ausência de microvilosidades. O citoplasma mostrou-se alterado, com a região apical hipodensa e desprovida de organelas e a baso-lateral com áreas de vacuolização.

HICKS e cols. (1996C) concluiram que apesar de aderirem às mucosas jejunal, ileal e colônica humanas, cepas de EAEC provocaram alterações morfológicas somente quando aderidas ao íleo e ao cólon. Foram descritas presença de vesiculação e perda das membranas das microvilosidades no cólon de adultos, e avaliando mucosa intestinal de crianças: adesão sem alterações morfológicas a jejuno; extrusão de células epiteliais sem alterações das microvilosidades no íleo, e extrusão de células epiteliais, vesiculação das microvilosidades, dilatação e abertura das criptas com aumento da liberação de muco na mucosa colônica. Houve evidência de excesso de extrusão celular tanto no intestino delgado quanto no grosso.

Os trabalhos citados sugeriram que a adesão ao intestino delgado poderia trazer efeitos adversos às capacidades absortiva e secretora desta região do trato gastrointestinal.

1.5. ESTUDOS DE INTERAÇÃO “IN VIVO”

Evidências experimentais concluiram que infecção por EAEC é acompanhada por efeitos citotóxicos sobre a mucosa intestinal. VIAL e cols. (1988) foram os primeiros a demonstrar lesões citotoxicas em infecção experimental de alças ligadas de coelhos e ratos “in vivo”, com amostras de EAEC. À ML, foram observados na mucosa ileal, achatamento das vilosidades, necrose hemorrágica do ápice das vilosidades e resposta inflamatória leve, com edema e infiltrado mononuclear da submucosa. Os autores propuseram que estas alterações estivessem relacionadas à presença de toxinas (VIAL e cols., 1988). TICKOO e cols. (1992) inocularam experimentalmente coelhos com EAEC observando o desenvolvimento de diarréia grave nestes animais. A análise da mucosa intestinal demonstrou achatamento de leve a moderado das vilosidades com fragmentação nuclear, sendo que estas alterações foram mais significativas no intestino delgado distal que no proximal. TZIPORI e cols. (1992) observaram presença de hiperemia moderada de intestino delgado distal e do ceco, e edema das vilosidades intestinais, em suínos gnotobióticos que haviam recebido amostras de EAEC por via oral. Neste estudo, estas cepas de EAEC provocaram diarréia e morte na maioria dos animais.

Tanto os estudos “in vitro” quanto os “in vivo” tem proposto que cepas de EAEC são responsáveis por estimular produção de muco pela mucosa intestinal, formando um biofilme, onde estas bactérias ficam encrustradas, ao invés de aderirem diretamente ao epitélio. WANKE e cols. (1990) demonstraram experimentalmente a adesão preferencial de amostras de EAEC à camada de muco de intestino delgado de coelho. A função do excesso de produção de muco na patogênese destas bactérias ainda não está elucidada. No entanto, a formação de um espesso biofilme sobre o epitélio deve estar relacionada à capacidade deste organismo de provocar diarréia e talvez de causar persistência do processo diarréico (NATARO, 1996). É importante notar que nem todas as amostras de EAEC provocam alterações na mucosa intestinal. Esta heterogeneidade parece ser a causa da dificuldade em estabelecer a verdadeira associação destas bactérias à diarréia em investigações epidemiológicas e em estudos com voluntários (NATARO & KAPER, 1998).

1.6. FATORES DE VIRULÊNCIA

1.6.1. Adesinas

Em 1992, estudando a cepa 17-2, NATARO e cols. demonstraram que a adesão agregativa desta cepa de EAEC está associada à presença de um plasmídeo de 60 MDa que codifica uma fímbria flexível, “bundle-forming”, de 2 a 3 nm de diâmetro, também responsável pela hemaglutinação em eritrócitos humanos. Esta fímbria foi denominada AAF/I (fímbria de aderência agregativa tipo I) e aparentemente está presente em várias espécies de EAEC. Em 1993, NATARO e cols. definiram que os genes necessários para conferir a expressão desta fímbria estão presentes em duas regiões não ligadas do plasmídeo. Os autores propuseram também, que algumas cepas de EAEC parecem exibir a adesão agregativa através da presença de outras adesinas (NATARO e cols., 1992; NATARO e cols., 1993 e NATARO e cols.,1994). SAVARINO e cols. (1994) após análise detalhada dos determinantes da região 1 da AAF/I encontraram quatro quadros de leitura aberta ("open reading frames" - ORFs): aggA, aggB, aggC e aggD envolvidos na sua biogênese e concluiram que os genes aggA e aggC codificam a maior subunidade fimbrial e a proteína "usher" de membrana externa, respectivamente. A região 2 da AAF/I também codifica um regulador denominado aggR que é necessário para a expressão da fímbria AAF/I da cepa 17-2 (NATARO e cols., 1994).

Mais recentemente, CZECZULIN e cols. (1997), relataram que o fenótipo AA da cepa 042 está codificado num plasmídio AA genética, fenotípica e morfologicamente diferente da AAF/I. Esta adesina fimbrial foi denominada AAF/II e está relacionada com a adesão à mucosa colônica humana. Estas fímbrias com 5 nm de diâmetro e apresentam - se como filamentos de feixes semi-rígidos. A sub-unidade fimbrial do plasmídeo da AAF/II (aafA) foi clonada, sequenciada e mutada, sendo que um mutante perdeu a capacidade de aderir ao tecido intestinal humano em cultura, sugerindo uma função destas fímbrias na capacidade de aderência das EAEC ao intestino humano. Os autores indicaram que as adesinas AAF representam uma família de adesinas fimbriais, as quais mediam a adesão agregativa nas EAEC. Dados de hibridação de colônias demonstraram que entre as espécies sonda AA+, existem produtoras de AAF/I e produtoras de AAF/II, além de algumas espécies que não expressam nenhuma das duas. Isto implicaria na possibilidade de existir uma adesina AAF/III e possivelmente outras mais. Estes dados foram posteriormente confirmados por ELIAS e cols. (1999A).

O fenótipo AA portanto, pode estar associado à presença de um plasmídeo de 60 a 65 MDa e com a expressão de uma ou mais fímbrias de aderência agregativa distintas. ELIAS e cols.(1999B) usando análise sequencial de nucleotídeos e mutagênese insercional, descreveram a sequência genética completa da fímbria AAF/II da cepa 042 e demonstraram a função do ativador transcripcional AggR na expressão da mesma.

OKEKE e cols. (2000) caracterizaram 131 cepas de EAEC isoladas de pacientes com diarréia aguda e controles usando para isto, sondas genéticas, testes "in vitro" e testes de resistência a agentes antimicrobianos. Os autores concluiram, por regressão logística, que EAEC deve ser um importante causador de doença diarréica em crianças na Nigéria. Além disto, propuseram que cepas de EAEC produtoras de AAF/II são virulentas quando em contacto com uma população susceptível, podendo provocar a doença.

1.6.2. Produção de toxinas

SAVARINO e cols. (1991), utilizando o modelo “Ussing Chambers”, indicaram que filtrados da cepa 17-2 produziram um aumento em diferença de potencial que os autores atribuiram à presença de uma toxina parcialmente termoestável, de peso molecular inferior a 10 kDa, protease sensível, aparentemente associada a um plasmídeo e genética e morfologicamente distinta da toxina termoestável (STa) da E. coli enterotoxigênica, a qual denominaram EAST1 (Enterotoxina termoestável das EAEC). Os autores concluiram que o plasmídeo de 60 MDa das EAEC representa um determinante crítico de virulência, sendo a propriedade de adesão agregativa e a produção de enterotoxinas termoestáveis vinculadas a ele. Em 1993, SAVARINO e cols. clonaram um fragmento de DNA do plasmídeo de virulência da cepa 17-2. A análise da sequência de DNA identificou uma ORF que codifica uma proteína de 38 aminoácidos. Esta ORF foi denominada astA e representa o gene estrutural da EAST1. Em estudo realizado com voluntários humanos, esta toxina foi identificada em apenas duas das quatro amostras referência de EAEC avaliadas (NATARO e cols., 1995). Portanto, o papel da EAST1 na secreção e na doença diarréica ainda não foi esclarecido, pois é encontrada tanto em cepas patogênicas quanto em cepas não patogênicas de EAEC, além de em outras categorias de E. coli (SAVARINO e cols., 1996). RICH e cols. (1999) encontraram genes codificando EAST1 em 40% das amostras de EAEC e não observaram relação entre a presença de genes codificando esta toxina e a gravidade da diarréia naquela população.

BALDWIN e cols. (1992) demostraram que espécies de EAEC promovem alterações celulares “in vitro”, que seriam causadas pela produção de uma toxina que, provocando a morte da célula epitelial, atuaria como um importante fator na persistência do processo diarréico causado pelas EAEC. ESLAVA e cols. (1993) identificaram duas proteínas de sobrenadantes de cultura de EAEC, uma com 108 e a outra com 116 kDa, capazes de produzir aumento de fluido e provocar lesões hemorrágicas e necróticas em alças ileais de ratos. NAVARRO-GARCIA e cols. (1998) demonstraram que a proteína de 108 KDa secretada por espécies de EAEC é uma toxina termolábil. Anticorpos policlonais sintetizados contra esta proteína, aboliram sua atividade enterotóxica e os autores concluiram que esta toxina é imunogênica, já que anticorpos contra ela foram identificados no soro de crianças com infecção por EAEC. Esta toxina foi denominada Pet (toxina codificada por um plasmídeo) e quando avaliada em células HEp-2 e HT29 provocou danos citopáticos e enterotóxicos (NAVARRO-GARCIA e cols., 1999). ESLAVA e cols. (1998) mostraram a sequência de nucleotídeos desta proteína de 108 KDa derivada de uma espécie patogênica de EAEC. O gene (pet) para esta toxina estaria localizado em um plasmídeo (Plasmídeo AA – pAA) de 65 MDa. Recentemente, HENDERSON e cols. (1999A), estudando o envolvimento da Pet nas lesões observadas no intestino humano infectado por EAEC, relataram que a toxina Pet é ativa na mucosa intestinal humana, mas que estas bactérias provavelmente apresentam outros mecanismos capazes de provocar lesões na mucosa. O gene que codifica a proteína de 116 kDa descrita por ESLAVA e cols. foi caracterizado por HENDERSON e cols. (1999B) que denominaram esta proteína, uma serino protease extracelular, de Pic (proteína envolvida na colonização intestinal). Os autores relataram que Pic parece possuir funções mucolítica, de resistência à morte mediada por complemento e de hemaglutinação, que seriam relevantes na colonização dos intestinos.

STEINER e cols. (1988) demonstraram que cepas de EAEC em contacto com células Caco-2 levam à secreção de IL-8 e ao recrutamento de neutrófilos para a superfície epitelial e que este efeito é provocado por uma proteína flagelar solúvel e termo-estável. Posteriormente, estes autores clonaram e sequenciaram esta proteína, identificando uma flagelina capaz de produzir inflamação intestinal e de potencializar os efeitos de outras toxinas como a EAST1 e a Pet (STEINER e cols., 2000).

1.6.3. Hemaglutinação (HA)

OLD e cols. (1989) demonstraram a presença de uma fibrila de 2,5 nm de diâmetro que pareceu ser responsável por um tipo distinto de hemaglutinação manose-resistente (MRHA) de duas espécies de EAEC quando cultivadas com eritrócitos de roedores. YAMAMOTO e cols. (1991) estudando uma cepa de EAEC observaram forte correlação entre hemaglutinação e aderência. NATARO e cols. (1992) estudaram uma amostra isolada de EAEC e revelaram a presença de uma fímbria "bundle forming”, denominada fímbria I da EAEC. Estes autores encontraram forte correlação entre presença desta fímbria, AA e MRHA. Eles observaram sensibilidade de 94%. As estruturas envolvidas na hemaglutinação devem estar envolvidas na adesão agregativa, já que a perda desta propriedade coincide com a perda da outra.

KNUTTON e cols. (1992) submeteram 44 amostras de EAEC, isoladas de crianças com diarréia na Índia e no Reino Unido, a testes de hemaglutinação. Aproximadamente 50% das amostras mostrou hemaglutinação manose-sensível (MSHA), enquanto todas, exceto 1 (F417B) mostraram MRHA. Espécies de mesmo sorotipo exibiram o mesmo modelo de hemaglutinação com diferentes tipos de hemácias.

SCOTLAND e cols. (1991) estudando cepas de EAEC, observaram que todos causaram MRHA em eritrócitos de ratos mas quando com eritrócitos de outros animais (humanos, bovinos e cobaios), a hemaglutinação foi variável ou ausente. Testes de hemaglutinação com eritrócitos de ratos foram considerados característicos para diagnosticar EAEC. Em 1993, JALLAT e cols. estudando espécies de E. coli isoladas de fezes colhidas de crianças e adultos hospitalizados por doença diarréica na França, observaram que 82% das EAEC aglutinaram eritrócitos humanos na presença de d-manose e somente 55% com eritrócitos de rato. QADRI e cols. (1994), avaliando propriedades de hemaglutinação em amostras de EAEC originárias de várias regiões geográficas com eritrócitos humanos e de ratos, macacos, ovelhas, coelhos e bovinos, observaram que a grande maioria das amostras causou MRHA, produzindo diferentes perfis de hemaglutinação. Uma vez que eritrócitos de diferentes tipos de animais possuem diferentes receptores, a interação bactéria-eritrócito poderia fornecer uma pista sobre a natureza dos receptores para estes patógenos na mucosa intestinal. Compostos contendo ácido siálico inibiram a hemaglutinação de muitos isolados. Portanto, EAEC seria um grupo heterogêneo de organismos possuindo diferentes tipos de adesinas, sendo que para muitas das cepas estudadas, estes radicais pareciam ser os receptores nos eritrócitos e possivelmente no trato intestinal. Estes autores também observaram alta correlação entre MRHA e positividade para a sonda AA, com uma sensibilidade de 83%. Finalmente, concluiram que as características de adesão das EAEC devem ser muito complexas para serem estudadas por simples testes de hemaglutinação.

YAMAMOTO e cols. (1997) estudando a cepa 042, verificaram que estas bactérias possuem um plasmídeo (p042) que está relacionado com a capacidade de promover hemaglutinação manose-resistente de eritrócitos humanos em baixas temperaturas (Crio-MRHA). Os autores indicaram que esta hemaglutinação mediada por plasmídeo parece ser a maior adesina da cepa 042.

1.6.4. Hemolisinas

BALDWIN e cols. (1992) isolaram uma proteína de 120.000 KDa, produzida por uma EAEC não hemolítica em ensaios padrão, que apresentou reação cruzada em "Western blot" com anticorpos que são sintetizados contra a região C-terminal da hemolisina das E. coli. Células HEp-2 expostas a sobrenadantes de cultura destas cepas, contendo esta hemolisina, mostraram elevação nas concentrações de cálcio intracelular, estimulando a fosforilação cálcio-dependente. Estas EAEC promoveram alterações celulares “in vitro” que podem estar relacionadas com os mecanismos responsáveis pelo desenvolvimento do processo diarréico “in vivo”. Os autores sugeriram que o aumento intracelular de cálcio desestabiliza a borda em escova através da estimulação das cadeias de miosina das microvilosidades, causando diarréia secretora através da fosforilação de proteínas envolvidas no transporte iônico através da membrana. Além disto, que a formação de poros no epitélio alterando a integridade da membrana e provocando morte celular, parece estar relacionada com a perpetuação do processo diarréico. HAQUE e cols. (1994) identificaram uma hemolisina de contacto em 37 de 45 cepas de EAEC avaliadas. A produção da hemolisina de contacto foi dependente da temperatura, pH, e condições de cultura, sendo que a atividade hemolítica foi maior com eritrócitos de carneiro, quando comparada com eritrócitos humanos e de outros animais.

Alguns autores, avaliando a cepa 17-2, observaram em células HEp-2, o modelo de adesão agregativa com citodestacamento (NATARO e cols., 1995). GOMES e cols., 1995, avaliaram 84 cepas de EAEC e encontraram apenas 10 capazes de destacar monocamadas de células HEp-2. Estas 10 amostras e a cepa 17-2, usada como controle positivo, reagiram quando testadas com a sonda para (-hemolisinas, enquanto somente uma das espécies não destacadoras reagiu com esta sonda. Os autores propuseram que a toxina responsável por este efeito fosse uma (-hemolisina e concluiram que este não parecia ser o fator mais importante relacionado a enteropatogeneidade destes agentes, sendo necessários mais estudos no sentido de avaliar o papel destas hemolisinas.

Em 1998, FERNADEZ-PRADA e cols., avaliando a infecção de macrófagos humanos derivados de monócitos (MHDM) e de células J774 com E. coli citodestacadoras e enteroagregativas, demonstraram que algumas cepas provocaram morte celular e liberação de mediadores inflamatórios (lactato desidrogenase e interleucinas). A morte celular ocorreu por oncose (necrose celular) nos MHDM e por apoptose (morte celular programada) nas células J774. Os autores concluiram que somente bactérias produtoras de hemolisinas provocaram estas alterações.

1.6.5. Proteínas de membrana externa

DEBROY e cols. (1995) sugeriram que uma proteína de superfície bacteriana, identificada em amostras de EAEC, isoladas de crianças com diarréia persistente na Índia, seria responsável pela adesão agregativa. Neste estudo, foram produzidos anticorpos contra esta proteína de superfície, que inibiram a adesão destas bactérias a células HEp-2 “in vitro”, o que poderia potencialmente impedir o desenvolvimento da doença. Outros autores descreveram proteínas de superfície bacteriana de 18 kDa nos sorotipos O126:H27 e O44:H18 e questionaram se estas proteínas conferiam ou não uma vantagem patogênica a estes sorotipos sobre as demais EAEC (CHART e cols., 1995).

WAI e cols. (1996) decreveram uma proteína de membrana externa em tres cepas de EAEC avaliadas. A análise destas proteínas através de eletroforese em gel de poliacrilamida, revelou a existência de uma única proteína de 38 KDa que quando extraída provocou a perda da capacidade hidrofóbica de superfície destas bactérias. Os autores concluiram que esta proteína de superfície parecia ter papel importante no fenótipo agregativo das EAEC. Posteriormente, CHART e cols. (1997A) concluiram que a proteína de 18kDA, anteriormente descrita por eles nos sorotipos O126:H27 e O44:H18, estava envolvida na adesão a células HEp-2 e na formação da película sobre os caldos de cultura e, que a retirada de íons Mg+2 do meio de cultura esteve correlacionada com a inabilidade destas amostras em aderirem a células HEp -2 e em produzirem a película.

Mais recentemente, foram analizadas 24 cepas de E. coli com características genotípicas e/ou fenotípicas de EAEC, com relação aos sorotipos e perfis de proteínas de membrana externa e uma grande diversidade genética nestes isolados bacterianos foi demonstrada (SUZART e cols., 1999).

1.6.6. Proteína anti - agregação (PAA)

Através do estudo genético da espécie 042, foi identificada uma proteína de 10 kDa cuja função foi investigada. Os autores observaram que mutantes sem PAA provocaram aumento significativo no número de agregados bacterianos. O inverso também foi observado. Esta proteína parece ser um novo fator de virulência das EAEC agindo como um fator controlador da agregação bacteriana (HICKS e cols., 2000).

1.6.7. Invasão

BENJAMIN e cols., 1995, estudando cepas de EAEC isoladas de crianças com diarréia persistente, observaram por MET, que estas bactérias foram internalizadas por células HeLa, também em ensaios com proteção de gentamicina. Os autores relataram que esta propriedade de cepas provenientes de diversas regiões geográficas poderia ser um fator de virulência deste grupo de bactérias. Até o momento, não existem outras evidências de que as EAEC sejam enteropatógenos invasores.

1.7. DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO POR EAEC

O desenvolvimento de sondas genéticas tem facilitado muito a identificação de cada uma das categorias de E. coli diarreiogênicas conhecidas (LEVINE e cols., 1988).

VIAL e colaboradores, em 1988, transferiram da cepa 042, o plasmídeo de 60 MDa para a E. coli HB101 transferindo para esta, a capacidade de exibir o fenótipo agregativo de adesão a células HEp-2. Neste estudo, os autores relataram que existe uma considerável homologia entre os plasmídeos de 60 MDa de diferentes sorotipos O:H de EAEC e que um fragmento de 1 kilobase (kb) da espécie 042 hibridou com 49% das EAEC avaliadas e com nenhuma das EPEC, EIEC (Escherichia coli enteroinvasora), EHEC (Escherichia coli enterohemorrágica) e ETEC (Escherichia coli enterotoxigênica), mostrando ter 49% de sensibilidade e 100% de especificidade quando usado como sonda genética em hibridações com vários isolados de E. coli.

BAUDRY e cols. (1990), à partir deste plasmídeo, isolado da cepa protótipo EAEC 17-2, produziram a primeira sonda genética (CVD 432) capaz de identificar as EAEC, com uma sensibilidade de 89% e especificidade de 99%, achado confirmado no estudo de KNUTTON e cols. (1992), que obtiveram hibridação de 43 das 44 amostras de EAEC testadas com esta sonda. Por outro lado, FARUQUE e cols. (1992) demonstraram que esta sonda, não hibridou 31,9% das cepas previamente caracterizadas como EAEC pelo modelo de adesão à células HeLa. ECHEVERRIA e cols, (1992) também atribuiram baixa sensibilidade a esta sonda (<50%) e OKEKE e cols. (2000) observaram somente hibridação de 26% das cepas de EAEC por eles avaliadas, com esta sonda. Isto leva à observação de que existe grande heterogeneidade destas bactérias com relação à expressão da adesão agregativa (AA), sugerindo também a existência de variantes genéticas dentro deste grupo de bactérias.

Em 1994, DEBROY e cols. desenvolveram uma nova sonda, a pVAP, a partir do plasmídeo de 60 MDa da cepa F03-1 (sorotipo O4:H7), isolada de uma criança com diarréia persistente na Índia (1994). Esta sonda apresentou sensibilidade de 93% e especificidade de 98% para identificação de EAEC naquela região geográfica.

Outras sondas tem sido utilizadas para identificação destas bactérias: hly, que codifica (-hemolisina (WELCH e cols., 1983); aggA, que codifica a sub unidade fimbrial AAF/I (NATARO e cols., 1992); astA, que codifica a enterotoxina termo estável da EAEC (EAST-1) (SAVARINO e cols., 1993); aggR que codifica o ativador transcripcional da AAF/I e da AAF/II (NATARO e cols., 1994); aafA, que codifica a sub unidade fimbrial AAF/II (CZECZULIN e cols., 1997); she, que codifica a proteína secretada pela S. flexneri (Pic) (RAJAKUMAR e cols., 1997); pet, que codifica a citotoxina plasmídeo codificada da EAEC (ESLAVA e cols., 1998); irp2 que codifica o gene biossintético Yersinea bactin (SCHUBERT e cols., 1998); aspU, que codifica a proteína criptica secretada plasmídeo-codificada (TOMPKINS e cols., 1999); aggC, que codifica a proteína "usher" AAF/I (RICH e cols., 1999); aafC, que codifica a proteína Usher AAF/II (ELIAS e cols., 1999A); shf, que codifica o ORF críptico (CZECZULIN e cols., 1999); 4 A18 que codifica a pAA2 incFII like replicon (OKEKE e cols., 2000).

Devido aos custos elevados, a identificação das EAEC tem se limitado aos laboratórios de pesquisa. Os testes com culturas de células ainda são os mais definitivos apesar de serem um método demorado, especialmente para a análise de múltiplas colônias de diversas amostras clínicas. Alguns autores tentaram criar métodos diagnósticos baratos e fáceis de serem realizados. ALBERT e cols., 1993, propuseram a formação de uma película na superfície dos caldos de cultura como teste específico para identificação das EAEC. No entanto, até o momento, não está definida sua importância na identificação destas bactérias.

Alguns autores sugeriram que hemaglutinação manose resistente (MRHA) seria um método suficientemente sensível na identificação destas bactérias (KNUTTON e cols., 1992; NATARO e cols., 1992). SCOTLAND e cols. (1991) concluiram que somente testes com hemácias de ratos seriam realmente diagnósticos para estas bactérias, uma vez que com eritrócitos de outros animais os resultados eram bastante variáveis. Posteriormente, JALLAT e cols.,1993, sugeriram que hemácias de ratos não seriam adequadas para testes de identificação destas bacterias e QADRI e cols., 1994, concluiram que testes de hemaglutinação não seriam adequados para o estudo de cepas de EAEC com características tão complexas.

CHART e cols. (1997B) avaliaram 29 cepas de EAEC e quatro controles com o uso de sondas genéticas e modelo de adesão em células HEp-2. Observaram também sua capacidade de expressão de proteínas de membrana externa, aglutinação de eritrócitos e formação de película na superfície dos caldos de cultura. Os autores preconizaram que somente o uso de sondas genéticas e o modelo de adesão em células HEp-2 seriam confiáveis como métodos de identificação destas bactérias.

Em 1998, KANG e cols. avaliaram o efeito do salicilato de sódio e do ácido 5-amino salicílico sobre a aderência de cepas de EAEC a células HEp-2 e eritrócitos de diferentes animais. Os autores observaram decréscimo significativo da aderência em 82,5% das cepas avaliadas e da hemaglutinação em 60,6% dos isolados. O decréscimo foi associado a diminuição ou ausência da expressão da fímbria em 70% das EAEC avaliadas, embora a produção de proteínas de membrana externa não tenha sido afetada. Salicilatos parecem inibir a aderência mediada por adesinas fimbriais.

Em 1995, SCHMIDT e cols. sugeriram o PCR (reação em cadeia da DNA polimerase), como método capaz de identificar EAEC. Os autores relataram que de 50 cepas de E. coli que demonstraram adesão agregativa em células HEp-2, apenas 7 foram negativas quando avaliadas pelo PCR. A razão para o fato de nem todas as cepas serem positivas para o método é desconhecida, mas alguns apontam a existência de diferentes categorias de EAEC (BAUDRY e cols., 1990; SCOTLAND e cols., 1991). ITOH e cols. (1997), avaliando por PCR, as 27 cepas de EAEC isoladas em estudo realizado no Japão, observaram que nenhuma delas revelou-se positiva para o método empregado.

Em relação a sorotipagem, amostras de E. coli podem ser classificadas a partir da determinação de seus antígenos somático (O), flagelar (H), e capsular (K). A combinação específica dos antígenos O, H e K ou somente O e H define o sorotipo de uma determinada amostra, sendo que certos sorotipos podem estar particularmente correlacionados com uma determinada categoria de E. coli diarreiogênica (ORSKOV & ORSKOV, 1992). Sorogrupos normalmente associados a categoria de EPEC tem sido descritos frequentemente em amostras de EAEC associadas a diarréia (CAMPOS e cols., 1994; CHAN e cols., 1994; GONZALEZ e cols., 1997; MORELLI e cols., 1994; VALLE e cols., 1997). No entanto, as amostras de EAEC podem pertencer a uma grande diversidade de sorogrupos diferentes (QADRI e cols., 1994; SCOTLAND e cols., 1991; SCOTLAND e cols., 1993; VIAL e cols., 1988; YAMAMOTO e cols., 1992). Devido a isto, a sorotipagem parece ser um meio pouco adequado para o diagnóstico presuntivo das EAEC, ao contrário do que ocorre particularmente nas categorias de EPEC e EIEC (SUZART, 2000).

A existência de diferentes sítios de colonização, diferentes fatores de virulência e a falta de achados histopatológicos característicos, tornam necessária a realização de estudos mais detalhados para buscar a elucidação do mecanismo patogenético destas bactérias.

2. OBJETIVO

Analisar por microscopia de luz (ML) e ultraestruturalmente, por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e de transmissão (MET), a interação de amostras de EAEC com células de mucosa intestinal humana preservada “in vitro”, observando e comparando as interações em diferentes regiões do trato digestivo (intestino delgado distal e intestino grosso).

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Amostras Bacterianas

As amostras de EAEC utilizadas neste estudo foram isoladas das fezes de pacientes portadores de diarréia persistente (EAEC - CASOS) e de um controle, sem patologia do trato gastrointestinal (EAEC - CONTROLE). As amostras EAEC - CASOS foram colhidas de crianças menores de 6 meses de idade que apresentavam diarréia pesistente (cepas 071 101 e 171). Como controle positivo, foi utilizada a cepa protótipo 042 (NATARO e cols., 1995).

A identificação de EAEC foi realizada com base em seu padrão de adesão agregativo a células HeLa e HEp-2 e com o uso de sonda genética específica - AA, que detecta os genes associados à propriedade de causar adesão do tipo agregativa - pCVD 432 (BAUDRY e cols., 1990). A identificação dos antígenos somático (O) e flagelar (H) foi realizada pelas técnicas de aglutinação padrão (EWING, 1986). Cepas não tipáveis foram definidas como NT. A sorotipagem da cepa RN 190/2 não foi realizada e portanto foi definida como ND (não determinada).

As características das EAEC empregadas neste estudo estão descriminadas na TABELA 1.

TABELA 1 Características das amostras de EAEC isoladas das fezes de pacientes com diarréia persistente a serem estudadas

3.2. Pesquisa de determinantes genéticos de virulência associados com E. coli patogênicas, através de ensaios de hibridação de colônias bacterianas e reação de polimerase em cadeia (PCR)

3.2.1. Preparo das amostras bacterianas para os ensaios de hibridação de colônias

Os filtros utilizados nos ensaios de hibridação de colônias foram preparados segundo a metodologia descrita por MAAS, 1983.

3.2.2. Sondas genéticas empregadas para testes de hibridação de colônias

3.2.2.1.Sequências de DNA (Ácido Desoxirribonucléico) clonadas

A TABELA 2 apresenta a relação das sondas moleculares testadas com suas respectivas características.

Os fragmentos de DNA empregados como sondas foram obtidos a partir de plasmídeos recombinantes através de digestão enzimática com endonucleases de restrição propriadas (sondas pCVD 432 e hly) ou através de PCR com oligonucleotídeos específicos (demais sondas). As reações de PCR foram realizadas a partir do DNA total da amostra protótipo 042 usando-se as condições descritas por CZECZULIN e cols., 1999.

3.2.2.2. Marcação isotópica dos fragmentos de DNA

Os fragmentos de DNA oriundos de plamídeos recombinantes foram marcados com ((-32 P(dATP através da técnica do "nick-translation" descrita por RIGBY e cols., 1977.

A pesquisa referida no ítem 3.2. foi realizada pelas Profs. Dras. Tânia Aparecida Tardelli Gomes do Amaral e Mônica Aparecida Midolli Vieira, do Departamento de Microbiologia, Parasitologia e Imunologia da Universidade Federal de São Paulo.

TABELA 2 Características das sequências genéticas empregadas como sondas genéticas que representam determinantes de virulência descritos em amostras da categoria EAEC

(1) - Open reading frame

a - As sondas pCVD 432 e hly foram obtidas a partir de fragmentos de DNA clonados, e as demais, a partir de reações de PCR

3.3. Estudo da interação de amostras de EAEC com células de mucosa intestinal humana preservada “in vitro”

3.3.1. Coleta de fragmentos intestinais humanos

Os fragmentos intestinais humanos foram obtidos em cirurgias de ressecção intestinal realizadas em pacientes pediátricos, pela equipe da Disciplina de Cirurgia Pediátrica da Escola Paulista de Medicina, no Hospital São Paulo (Universidade Federal de São Paulo) e também em colonoscopias realizadas em pacientes adultos pela equipe responsável pelo setor de Gastroenterologia Clínica do Hospital São Paulo (Escola Paulista de Medicina – Universidade Federal de São Paulo).

Estes fragmentos foram colhidos de pacientes para os quais houve indicação prévia de realização dos procedimentos cirúrgicos e endoscópicos acima citados. Os fragmentos de cólon foram colhidos em procedimentos cirúrgicos em que não foram observadas alterações no epitélio colônico, por exemplo: cirurgia para correção de megacólon congênito. Quando os fragmentos foram obtidos por colonoscopia, as coletas somente foram realizadas em regiões do cólon que não apresentavam alterações. Fragmentos de íleo foram colhidos em procedimento cirúrgico de ressecção de divertículo de Meckel, aonde não se observaram alterações no epitélio ileal. Os fragmentos de íleo colhidos por colonoscopia também foram retirados de regiões do epitélio sem alterações. As biópsias mediam 2 a 3 mm de diâmetro e foram então, colocadas em frascos contendo meio de cultivo de órgão modificado (MCOM)(ítem 7.5.1.2.4.- Anexo 5) e transportadas ao laboratório a 4oC.

Antes do início dos procedimentos, foram obtidos termos de consentimento para a coleta dos fragmentos (Anexos-1, 2. 3 e 4).

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética da EPM-UNIFESP (ítem - 7.6. ANEXO 6).

3.3.2. Preparo e preservação de fragmentos intestinais humanos para os testes

Dos fragmentos mantidos em MCOM, um foi colocado em paraformaldeído a 4% (ítem 7.5.1.3.2.- Anexo 5) para processamento em ML e outro em fixador Karnovsky (Km) (ítem 7.5.1.4.1.-Anexo 5), para processamento em microscopia eletrônica, afim de monitorar a viabilidade do tecido.

Os demais fragmentos mantidos em MCOM, foram lavados cuidadosamente com Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco-Vogt (PBS-D-V) (ítem 7.5.1.2.1.-Anexo 5) a 4ºC e transferidos para um sistema de cultivo de órgão adaptado, onde foram utilizadas placas de Petri descartáveis de 3,5 cm de diâmetro (CORNING) contendo membranas AP20 (MILLIPORE). Neste sistema, com auxílio de um microscópio estereoscópico (NIKON), 3 fragmentos intestinais, foram dispostos na membrana, de forma que as vilosidades fossem orientadas para a luz e assim ficassem expostas. A seguir, a membrana foi saturada com meio de cultivo de órgão modificado com 2% de d-manose (MCOMm) (ítem 7.5.1.2.4.-Anexo 5), de maneira que uma fina camada de meio de cultura cobrisse a superfície dos fragmentos intestinais.

3.3.3. Preparo de culturas bacterianas para os testes de interação

Culturas bacterianas das amostras de EAEC mantidas em ágar nutriente (ítem 7.5.1.1.2.-Anexo 5) foram inoculadas em caldo triptona de soja (TSB) (ítem 7.5.1.1.1.-Anexo 5) e incubadas em estufa a 37( C por 18 horas. Nos testes de interação, estas culturas foram utilizadas em concentrações finais de aproximadamente 109 bactérias por ml em TSB.

3.3.4. Teste de Interação

O teste da interação bactéria - célula foi realizado utilizando-se sistemas de cultivo de órgão adaptado, preparados como descrito no ítem 3.3.2. Foram empregados um período de infecção de 2 horas e períodos de multiplicação de 2, 4 ou 6 horas. Cada amostra bacteriana foi testada em triplicata, em placas de Petri, com 3 fragmentos intestinais cada uma. Como controle negativo do teste de interação, uma das placas foi preparada com 3 fragmentos intestinais sem caldo bacteriano. Todos os fragmentos foram processados, paralelamente, para microscopia de luz (ML), microscopia eletrônica de varredura (MEV) e microscopia eletrônica de transmissão (MET). Este processamento foi realizado no Centro de Microscopia Eletrônica - Escola Paulista de Medicina - Universidade Federal de São Paulo (CEME/EPM/UNIFESP) sob a supervisão da Profa. Dra. Edna F. Haapalainen.

3.3.4.1. Processamento de células de mucosa intestinal humana preservada para visualização através de ML

Após lavagem dos fragmentos intestinais testados com MCOMm, estes foram fixados, utilizando-se uma solução de paraformaldeído a 4% (ítem 7.5.1.3.2.-Anexo 5) durante 24 horas. Foi realizada então, desidratação sequencial com etanol a 70% por 60 minutos, a 90% por 120 minutos e 100%, efetuando-se tres trocas com intervalos de 120 minutos, à temperatura ambiente. Após, foi realizada pré infiltração com uma mistura de etanol a 100% e glicolmetacrilato (GMA-resina Historesin) (LKB) (ítem 7.5.1.3.3.-Anexo 5) em partes iguais por 12 horas à temperatura ambiente e então, os fragmentos foram transferidos para a solução de infiltração GMA por 24 horas. Os fragmentos orientados com auxílio de um microscópio esteroscópico, de forma que as vilosidades intestinais ficassem voltadas para cima, foram incluídos, à temperatura ambiente, em uma mistura de resina Historesin e GMA contida em moldes de silicone do kit Historesin. A polimerização da resina ocorreu após 18 horas em estufa à 37(C e os blocos foram cortados em micrótomo (SORVALL JB 4A), com navalha de vidro (EMS), numa espessura de 1,0 (m. A seguir, os cortes foram estirados em água destilada gelada, transferidos para lâmina de vidro e corados pela solução de azul de toluidina a 1% (ítem 7.5.1.3.4.-Anexo 5) por 4 minutos e a seguir em solução de fucsina (ítem 7.5.1.3.5.-Anexo 5) por 30 segundos (toluidina-fucsina). Todos os cortes foram montados em bálsamo do Canadá e observados ao microscópio de luz com aumentos de 100, 200, 400 e 1000X.

3.3.4.2. Processamento de células de mucosa intestinal humana preservada para visualização através de MET

Após realização dos testes de interação (ítem 3.3.4.), os fragmentos intestinais foram submetidos à diversas lavagens em tampão cacodilato de sódio-HCl 0,1M (ítem 7.5.1.3.1.-Anexo 5), e fixados com solução Karnovsky (Km) (ítem 7.5.1.4.1.-Anexo 5) durante 2 horas à temperatura ambiente. A seguir, foram efetuadas 2 lavagens de 15 minutos cada uma com tampão cacodilato de sódio-HCl e os fragmentos intestinais foram pós fixados com tetróxido de ósmio a 1% (ítem 7.5.1.4.2.-Anexo 5) durante uma hora. Os fragmentos foram então lavados com água por 2 vezes e à seguir colocados em solução de acetato de uranila a 0,5% (ítem 7.5.1.4.3.-Anexo 5) em sacarose por 30 minutos. Após novas lavagens, os fragmentos intestinais foram desidratados 2 vezes por 30 minutos em etanol a 70, 90 e a 100%. Para garantir a desidratação total, foram tratados ainda mais uma vez por 30 minutos em álcool a 100% e, em seguida, 2 vezes em óxido de propileno p.a.. Os fragmentos foram então, infiltrados com óxido de propileno e resina Araldite (ítem 7.5.1.4.4.-Anexo 5), nas proporções 1:3, durante 1 hora; 1:2, durante 60 minutos e 1:1, durante 18 horas à temperatura ambiente, sob branda agitação até a evaporação completa do óxido de propileno. Após a infiltração, os fragmentos foram colocados em mistura de resina Araldite pura por 3 horas e infiltrados sob vácuo, em um dessecador. A seguir, foram incluidos em moldes de silicone e mantidos em estufa a 60(C durante 72 horas, para a polimerização da resina. Os blocos foram então cortados em micrótomo (SORVALL JB 4A), com navalha de vidro, numa espessura de 0,5 a 1,0 (m. Os cortes semi-finos foram então estirados em água destilada gelada, transferidos para lâmina de vidro e corados pela solução de azul de toluidina a 1% (ítem 7.5.1.3.4.-Anexo 5) por 2 minutos. Todos os cortes foram montados em bálsamo do Canadá e observados ao microscópio de luz com aumentos de 400 e 1000X.

De cada bloco da preparação, cortes ultra-finos de 90 nm foram obtidos em ultramicrótomo MT2 (SORVALL) com navalha de diamante (LADD). Os cortes, colhidos em telas de cobre (EMS) foram corados com solução de acetato de uranila a 2% (ítem 7.5.1.4.5.-Anexo 5) durante 15 minutos e com solução de citrato de chumbo a 0,88% (ítem 7.5.1.4.6.-Anexo 5) (REYNOLDS, 1963) durante 5 minutos. Os cortes foram examinados em MET (JEOL JEM-1200 EX II), operando a 80Kv.

3.3.4.3. Processamento de células de mucosa intestinal humana preservada para visualização através de MEV

Após lavagem dos fragmentos intestinais testados, estes foram fixados e pós fixados conforme descrito no ítem 3.3.4.2.. A seguir, foram realizadas outras 2 lavagens com tampão cacodilato de sódio - HCl 0,1M (ítem 7.5.1.3.1.–ANEXO 5), e então, os 3 fragmentos intestinais referentes a cada amostra bacteriana, foram transferidos para cestas permeáveis individualizadas, as quais foram colocadas em um recipiente com etanol a 50%, iniciando-se o processo de desidratação. A seguir os fragmentos foram desidratados 2 vezes por 10 minutos em etanol a 50, 70, 90 e 3 vezes por 10 minutos em etanol a 100%. As cestas com os fragmentos foram mergulhadas em etanol absoluto p.a. (MERCK) por 5 minutos e submetidas à câmara do aparelho de secagem (BALZERS CPD 030) pelo método de ponto crítico do gás carbônico, para ser efetuada a substituição do etanol absoluto por gás carbônico. Em seguida, com o auxílio de um microscópio esteroscópico, os 3 fragmentos intestinais referentes a cada amostra bacteriana foram orientados com as vilosidades direcionadas para cima e colocados em um suporte porta-amostra para varredura, aderidos com prata coloidal (EMS) para melhorar a condutividade. Após a montagem, os fragmentos foram submetidos ao metalizador (BALZERS - Sputter Coater SCD 050) para deposição de uma fina camada de ouro (método de “Sputtering”) (MURPHY & ROOMANS, 1984) sobre as preparações, tornando-as condutoras. As observações foram realizadas no MEV (JEOL JSM - 5300), operando em 10Kv.

4. RESULTADOS

4.1. Pesquisa de sequências de DNA relacionadas com possíveis determinantes de virulência de diferentes categorias de E. coli patogênica

Os resultados da análise de sequências genéticas específicas, relacionadas com diferentes genes potencialmente associados com virulência em E. coli patogênica estão relacionados na TABELA 3.

TABELA 3 Distribuição de sequências de DNA associadas a determinantes genéticos de virulência descritos em amostras de EAEC em cepas de E. coli com características fenotípicas e genotípicas de EAEC

Em resumo:

042: pCVD432, aggR aafA aafC she shf, pet, astA, aspU, irp2
071-1:  pCVD 432, aggC, aggR, she, irp2
101-1:  pCVD 432, aggR, shf, she, irp2
171-1:  pCVD 432, aggR, aggC, irp2
RN 190/2: pCVD 432 aggR aggC, she, astA, aspU, irp2

Assim, as amostras 071-1, 171-1 e RN190/2 devem produzir uma variante AAF/I, já que não hibridam com aggA, mas hibridam com aggC, que codifica a proteína "usher" da AAF/I e aggR, que codifica o ativador transcripcional. A cepa 101-1 deve produzir outra variante AAF, uma vez que hibrida com aggR, e não hibrida com aggA, aggC, aafA e aafC. Somente a cepa protótipo (042) hibrida com a sonda que codifica Pet. As cepas 071-1, 101-1 e RN190/2 hibridam com a sonda que codifica Pic. Nenhuma das cepas hibridou com a sonda hly. Somente as cepas 042 e RN 190/2 hibridam com as sondas astA e aspU que codificam a toxina EAST-1 e a proteína criptica secretada respectivamente.

4.2. Interação de cepas de EAEC com fragmentos de mucosa intestinal humana

Para avaliar possíveis alterações geradas pelo procedimento e não pelos agentes bacterianos, foram fixados fragmentos imediatamente após a coleta (controle direto) e fragmentos não infectados após o término do processamento (controle negativo). Não foram observadas alterações nos controles negativos, mas as encontradas e que pareceram mais proeminentes em fragmentos de cólon, não aparentaram ser significativas quando comparadas aos fragmentos infectados pelas cepas bacterianas. Não foram observadas bactérias nos fragmentos controle. Os fragmentos controle apresentaram menos muco que os infectados pelas cepas de EAEC.

4.2.1. CÓLON

4.2.1.1. Microscopia de luz (ML)

4.2.1.1.1. Controles

4.2.1.1.1.1 Direto - Os fragmentos mostraram superfície celular preservada com enterócitos em paliçada. As células caliciformes e a bordadura estriada mostraram-se intactas (Fig. 1A, 1B, 1C e 1D ).

4.2.1.1.1.2. Negativo - Foram observadas áreas de extrusão celular. Foi demonstrado grande número de células caliciformes permeando enterócitos aparentemente preservados (Fig 2A, 2B, 2C e 2D).

4.2.1.1.2. Cólon - Cepa 042

A análise da mucosa colônica infectada com a cepa 042 revelou a presença de bactérias na luz intestinal e na camada de muco que recobre o epitélio (Figs. 3D, 4A, 4B, 4C e 4D). Em algumas regiões, bactérias apareceram em contacto com a bordadura estriada (Figs. 3D, 4B, 4C e 4D). Focalmente, foram demontradas áreas de descolamento do epitélio (Figs. 3A; 3B, 3C, 3D, 4A, 4C e 4D). Em várias regiões do tecido ocorreu vacuolização citoplasmática da região basal dos enterócitos (Figs. 3B, 3C, 3D, 4B, 4C e 4D).

4.2.1.1.3. Cólon - Cepa 171-1

A mucosa colônica infectada com a cepa 171-1 mostrou bactérias aglomeradas em "pilhas de tijolos" longe da superfície epitelial, em meio a células inflamatórias (Figs. 5A, 5B e 5C ). Foram observados grumos de bactérias próximos ao epitélio, em áreas aonde foi documentada a presença de restos celulares (Fig. 5D). No epitélio, grande quantidade de células caliciformes com áreas de lise, destruição e extrusão celular foram observadas (Figs. 5A, 5B, 5C e 5D). Nestes locais, as bactérias apareceram em contacto mais íntimo com a superfície do tecido (5D).

4.2.1.1.4. Cólon - Cepa 71-1

Cortes de fragmentos de mucosa colônica mostraram a cepa 71-1 em aglomerados típicos, próximos ao epitélio, que encontrou-se, em algumas áreas, despregado do córion (Fig. 6A). Extrusão celular também foi documentada (Figs. 6B e 6D). A bordadura estriada pareceu intacta em muitas regiões (Fig. 6C), mas nos locais aonde as bactérias encontraram-se aderidas, as microvilosidades mostraram-se alteradas (Fig. 6B).

4.2.1.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

4.2.1.2.1. Controles

4.2.1.2.1.1. Direto

A análise da mucosa colônica mostrou enterócitos em paliçada, porém com raras áreas de vacuolização citoplasmática (Fig.11A).

4.2.1.2.1.2. Negativo

A análise dos fragmentos de controle negativo revelou enterócitos em paliçada, entremeados por células calciformes com grande quantidade de muco em seu interior (Fig. 11B).

4.2.1.2.2. Cólon - 171-1

Na avaliação da mucosa colônica infectada com a cepa 171-1, foi documentada sugestão de internalização bacteriana. O epitélio apresentou-se com áreas de lise, nas quais agregados bacterianos foram observados em proximidade. Nestes locais, foi demonstrada uma bactéria entre um enterócito e uma célula caliciforme (Figs. 12A e12B). Em áreas de extrusão celular, bactérias foram vistas no citoplasma celular, envolvidas por vacúolos (Fig. 13A). Na sub-mucosa, foram demonstradas bactérias próximas a fibras de colágeno (Figs. 13B e 13C).

4.2.1.2.3. Cólon - 042

Nos fragmentos infectados com a cepa 042, as bactérias foram observadas na superfície epitelial que apresentou áreas de destruição (Fig.14A). Na base dos enterócitos foram documentados vacúolos de conteúdo homogêneo que apareceram em tamanhos variados (Figs.14A e.15A). Os vacúolos, em determinadas regiões, mostraram-se rompidos provocando o despregamento do epitélio (Fig. 14A). Na sub-mucosa, também foram encontradas bactérias próximas a fibras de colágeno (Fig. 14B). Na superfície epitelial, em áreas aonde bactérias foram observadas em proximidade, vesiculação de microvilosidades foi demonstrada (Figs. 15C e 15D).

4.2.1.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

4.2.1.3.1. Cólon Controle

Os fragmentos controle de mucosa colônica mostraram bordadura estriada preservada. Foi observado muco sobre a superfície do tecido (Fig. 19A).

4.2.1.3.2. Cólon - Cepa RN/190

A cepa isolada de fezes de paciente sem diarréia mostrou o mesmo padrão das isoladas de pacientes com diarréia persistente. Foram vistos agregados típicos encrustrados em espessa camada de muco e em determinadas regiões em proximidade com o epitélio aparentemente intacto (Fig. 20B).

4.2.1.3.3. Cólon - Cepas 042, 171-1,101-1 e 71-1

No cólon infectado com cepas de EAEC observaram-se bactérias aderidas a material mucoso, dispostas em padrão característico de adesão agregativa. Em determinadas regiões, os típicos agregados bacterianos em "pilhas de tijolos" apareceram encravados em espessa camada de muco (Figs 21A, 21B, 22B e 22C). Em outras, as bactérias mostraram-se aderidas diretamente ao epitélio que apresentou a borda em escova preservada (Figs. 21C).

Nos fragmentos infectados pelas amostras de EAEC, foi observada presença de maior quantidade de muco do que nos fragmentos controle que apresentaram sua estrutura aparentemente intacta.

As bactérias revelaram estruturas longas em sua superfície que parecem mediar a adesão ao muco, ao epitélio e às outras bactérias (Figs 24A e 24B).

4.2.2. ÍLEO

4.2.2.1. Microscopia de luz (ML)

4.2.2.1.1. Controles

4.2.2.1.1.1. Direto - A análise do epitélio mostrou tecido intacto com arquitetura vilositária preservada, enterócitos em paliçada com células caliciformes em grande número, sem anormalidades aparentes. A borda em escova apresentou-se aparentemente intacta (Figs. 7A e 7B).

4.2.2.1.1.2. Negativo - A mucosa mostrou vilosidades encurtadas, sem áreas de extrusão celular, mostrando grande número de células caliciformes e com bordadura estriada aparentemente preservada (Figs. 8A e 8B).

Nos cortes controle não foi observado muco, nem restos celulares na superfície epitelial.

4.2.2.1.2. Íleo - 171-1

A análise da mucosa ileal infectada com a cepa 171-1 revelou regiões aonde esboços de vilosidades apresentaram epitélio totalmente arrancado ou destruído (Figs. 9A, 9B, 9C e 9D). Restos de criptas foram observados (Fig. 9A). As bactérias foram documentadas em aglomerados típicos e em algumas regiões em aparente invasão secundária (Fig. 9D).

4.2.2.1.3. Íleo - Cepa 042

A análise da mucosa ileal infectada com a cepa 042 revelou vilosidades com áreas de arrancamento do epitélio que apresentou-se despregado do córion em algumas regiões (Figs. 10A, 10B, 10C e 10D). Foram observados aglomerados bacterianos próximos às microvilosidades da superfície epitelial arrancada e nas áreas destruídas do tecido (Figs. 10C e 10D).

4.2.2.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)

4.2.2.2.1. Íleo - Controle

4.2.2.2.1.1. Íleo - Controle direto

A mucosa ileal mostrou-se preservada apresentando enterócitos em paliçada com bordadura estriada intacta, entremeados por células caliciformes (Fig.16A).

4.2.2.2.1.2. Íleo - Controle Negativo

A análise dos fragmentos de mucosa ileal revelou epitélio preservado com enterócitos em paliçada, entremeados por células caliciformes. Neste material, a borda em escova apresentou-se íntegra (Fig.16B).

4.2.2.2.3. Íleo - 171-1

A análise de fragmentos de íleo infectados com a cepa 171-1 demonstrou arrancamento do epitélio com bactérias aglomeradas na superfície do tecido destruído (Figs. 17A e 17B).

4.2.2.2.4. Íleo - 042

Os fragmentos de íleo infectados com a cepa 042 revelaram superfície epitelial com áreas de destruição mostrando microvilosidades ora preservadas, ora vesiculadas e arrancadas (Figs. 18A e 18B). Na base dos enterócitos foram demonstrados vacúolos de conteúdo homogêneo de variados tamanhos (Figs. 18A, 18B, 18C e 18D). Os vacúolos, em algumas regiões, pareceram estar rompidos provocando o despregamento do epitélio (Fig. 18A). Foi sugerida invasão bacteriana, uma vez que, na região aonde foram visualizados os vacúolos, foram vistas bactérias próximas às fibras de colágeno (Figs. 18A, 18B, 18C e 18D).

4.2.2.3. Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)

4.2.2.3.1. Controle

Os fragmentos mostraram mucosa ileal com bordadura estriada preservada. Foram observadas muitas gotículas de muco sobre o epitélio (Fig. 19B).

4.2.2.3.2. Íleo - Cepas 042, 171, 101, 071

A mucosa ileal revelou amostras de EAEC formando agregados típicos, em pilhas de tijolos, encrustados em espessa camada de muco recobrindo o epitélio. Algumas bactérias encontraram-se aderidas diretamente à mucosa intestinal. As diferentes cepas avaliadas mostraram o mesmo padrão, especialmente as cepas selvagens e a cepa 042 (Figs. 23A, 23B, 23C e 23D).

4.2.2.3.3. Íleo - Cepa RN/190

Quantificação bacteriana não foi realizada, mas a cepa RN 190/2, proveniente de criança sem quadro diarréico também formou agregados bacterianos aderindo a camada de muco e ao epitélio ileal (Fig 20A).

5. DISCUSSÃO

Diarréia persistente, com a introdução da terapia de rehidratação oral e diminuição consequente da mortalidade provocada por diarréia aguda, aparece agora como causa mais importante de morbidade e mortalidade que esta (MC AULIFFE e cols.,1986; SHORLING e cols.,1990B, LIMA e cols.,1992 e BHAN e cols.,1993).

Os mecanismos fisiopatológicos que atuam na perpetuação do processo diarréico incluem alterações no intestino delgado, local aonde ocorrem as funções digestivo-absortivas. Estas alterações provocam perda de dissacaridases e outras enzimas, o que impede a absorção de carbohidratos e outros elementos da dieta, que não sendo absorvidos no local, passam a ser eliminados nas fezes. Estudo realizado com colonização de alças ligadas de coelhos com E. coli categorizadas como não toxigênicas concluiu que estas bactérias provocaram diarréia secretora em 50% dos animais colonizados, com aumento da secreção intestinal de água, sódio e cloro; e diminuição da atividade das dissacaridases. À microscopia eletrônica, as bactérias foram visualizadas na camada de muco e em proximidade com a bordadura estriada aparentemente intacta. Os autores afirmaram que estas bactérias parecem apresentar maior afinidade ao muco que ao epitélio e aderem inicialmente a este para em seguida, por mecanismos variados, atingir a bordadura estriada. Estas alterações funcionais seriam responsáveis por importantes consequências nutricionais, especialmente se persistentes (SCHLAGER e cols., 1990). Enquanto as bactérias permanecem na região, o processo perpetua-se e mesmo após sua eliminação, tende a continuar, uma vez que as lesões provocadas pelos enteropatógenos geram o rompimento dos mecanismos de defesa do organismo, permitindo a penetração de macromoléculas que desencadeiam intolerâncias alimentares, especialmente às proteínas da dieta, o que promove a perpetuação do processo diarréico. Vários fatores parecem estar relacionados ao fato de haver diferenças quanto às consequências sobre a função intestinal após a infecção. Está bem estabelecido que a diarréia persistente, especialmente quando complicada por hipersensibilidade às proteínas da dieta, sempre está associada com alterações histopatológicas focais. Algumas áreas do intestino delgado apresentam-se muito comprometidas enquanto que outras, parecem menos afetadas dentro de um mesmo fragmento de biópsia (MANUEL e cols., 1979). Este padrão focal aparentemente é a causa da falta de correlação entre a gravidade dos achados histopatológicos e a atividade das dissacaridases (SHULMAN e cols., 1991).

A diarréia persistente predispõe o indivíduo à desnutrição e suas nefastas consequências. Está bem estabelecida a relação entre estado nutricional e processo diarréico (SCHORLING e cols.,1990A, THANH e cols.,1992). Alguns autores reafirmaram a importância do estado nutricional como fator de risco para a diarréia persistente, (ARAYA e cols., 1991). Em relação à associação entre o tempo de duração da diarréia e o estado nutricional, outros mostraram que crianças desnutridas apresentam episódios diarréicos mais longos que as eutróficas (BLACK e cols.,1984; SCHORLING e cols.,1990A). Estes estudos confirmam a influência do hospedeiro na manifestação clínica do processo diarréico provocado pelo agente bacteriano.

FAGUNDES NETO e cols. (1984), estudando a ultraestrutura do intestino delgado na diarréia persistente, mostraram que na fase ativa da doença, a grande maioria das biópsias estudadas apresentava alguma anormalidade. Estas anormalidades ultraestruturais traduziam a existência de inúmeras alterações na microecologia do intestino delgado justificando assim plenamente a evolução clínica tormentosa e progressivamente fatal das crianças portadoras de diarréia persistente. Alguns dos pacientes estudados mostraram recuperação “ad integrum” da mucosa intestinal após a resolução clínica do processo, o que demonstrou que a diarréia persistente trata-se, nesta situação, de um processo patológico adquirido que admite recuperação da mucosa intestinal desde que rompido o ciclo vicioso diarréia-desnutrição.

Estudos "in vitro" tem facilitado a avaliação da interação bacteriana a tecido intestinal humano. Esta técnica tem sido empregada com tecido intestinal de animais (BATT e cols., 1987; BATT e cols.,1995), tecido intestinal humano (KNUTTON e cols., 1987A; KNUTTON e cols., 1987B; KNUTTON e cols., 1992; HICKS e cols., 1996B) e também com enterócitos isolados (KNUTTON e cols., 1987B; RAJ e cols., 1990). Com estes métodos é viável avaliar lesões provocadas pelo agente bacteriano, pois é possível manter células de intestino delgado, em sistemas de cultivo de órgão, vivas e em renovação contínua, por mais de 24 horas (BROWNING & TRIER, 1969).

Com relação às EAEC, outras variáveis devem ser consideradas. Limitações éticas tem dificultado o uso de grandes quantidades de tecido humano, especialmente proveniente de crianças, em investigações da patogênese destes agentes. A idade do hospedeiro deve ser um importante fator relacionado à aderência bacteriana. Alguns autores concluiram que existem diferentes receptores na mucosa intestinal de crianças que as tornam mais susceptíveis à colonização de agentes bacterianos (NATARO & KAPER, 1998). Devido a isto, procurou-se empregar neste estudo, mucosa intestinal coletada de pacientes pediátricos, mas por diversas razões de ordem prática, em muitas ocasiões, tornou-se inviável a obtenção de fragmentos de íleo destes pacientes. As coletas foram, na sua maioria, realizadas em cirurgias previamente agendadas. Como não são frequentes os procedimentos nesta região do aparelho digestivo, parte do material usado nestes experimentos foi obtido em colonoscopias de pacientes adultos. Na literatura, alguns trabalhos avaliando a interação de cepas de EAEC com intestino humano, utilizaram fragmentos intestinais de crianças e de adultos (YAMAMOTO e cols., 1991; YAMAMOTO e cols., 1992), não observando diferenças quanto ao grau de aderência. KNUTTON e cols., 1992, e HICKS e cols., 1996C também demonstraram resultados em fragmentos coletados de pacientes adultos. Baseados nestes dados, foram incluidos neste estudo, fragmentos de íleo e cólon de adultos e de crianças.

Diversidade quanto às manifestações provocadas por estas bactérias também podem ocorrer. Ainda não está claro o motivo pelo qual existe evidente associação entre o isolamento de cepas de EAEC e diarréia em alguns estudos epidemiológicos e em outros não. Isto pode estar relacionado à conhecida heterogeneidade destes agentes no que diz respeito aos fatores de virulência, sendo que espécies altamente virulentas podem ser mais frequentemente encontradas em determinadas regiões geográficas que em outras. Além do que, a capacidade de um organismo de provocar diarréia parece estar relacionada a variáveis do hospedeiro (OKEKE e cols, 2000). NATARO e cols. (1995), analisaram 4 cepas de EAEC em voluntários humanos e observaram que somente a cepa 042 provocou diarréia em 3 dos 5 voluntários adultos que a receberam. SPENCER e cols., 1999, caracterizaram 22 cepas de EAEC isoladas em quatro epidemias de doença diarréica na Inglaterra e concluiram que estas cepas pertenciam a vários sorotipos e possuíam variações fenotípicas bastante heterogêneas. Os autores sugeriram que EAEC deve utilizar vários mecanismos de adesão para produzir o padrão característico em "pilha de tijolos". SUZART e cols. (1999) analisaram 24 cepas de E. coli com características genotípicas e/ou fenotípicas de EAEC e observaram grande diversidade genética nestes isolados bacterianos.

Neste estudo, foram avaliadas: a cepa protótipo 042, cepas selvagens coletadas de pacientes menores de 1 ano e portadores de diarréia persistente que demonstraram padrão semelhante de adesão agregativa em células HeLa e HEp-2 e também uma cepa isolada de criança sem diarréia. Estas bactérias (TABELAS 1 e 2) pertencem a sorotipos diversos. A cepa proveniente de fezes de criança sem diarréia aderiu em padrão agregativo aparentemente sem diferenças em relação às obtidas de pacientes internados por doença diarréica. É possivel que os mecanismos de defesa do hospedeiro estejam relacionados com a manifestação clínica ou não do indivíduo infectado pelo agente, além do que, devem existir receptores específicos que se presentes no hospedeiro, determinariam a possibilidade de colonização do agente bacteriano.

Nesta avaliação, foi confirmada a afinidade destes agentes às regiões do trato digestivo ricas em muco. Existiu liberação significativa de muco nos fragmentos, tanto de íleo quanto de cólon infectados por estes agentes. Por MEV, nas duas regiões avaliadas, foram documentadas áreas em que as bactérias mostraram-se aderidas em padrão AA típico encrustradas em espesso biofilme de muco (Figs. 21A, 21B, 21C; 22B, 22C; 23A e 23C). Este padrão foi observado em todas as cepas, embora também tenham sido documentadas regiões em que as bactérias apresentaram-se em contacto direto com o epitélio (Figs: 20B, 22A, 23A, 23B, 23D; e 24B). Por ML, apesar de não ter sido utilizada coloração específica para muco, foram demonstradas algumas regiões em que o biofilme de muco apareceu recobrindo o epitélio (Fig.4A). A quantidade de muco foi maior nos fragmentos infectados que nos controles. Estes resultados de nossos experimentos foram similares aos de HICKS e cols (1996B), que também monstraram maior quantidade de muco em fragmentos infectados com cepas de EAEC do que nos controles. Estes autores concluiram que "in vivo", a bactéria deve penetrar a barreira de muco, afim de alcançar o epitélio. O sistema de cultura de orgão permite acesso direto à mucosa, o que indica que a produção excessiva de muco observada nos fragmentos infectados por EAEC seja uma resposta à infecção, já que este excesso não é observado nos fragmentos controle. WANKE e cols., 1990, já haviam relatado a forte afinidade destas bactérias ao biofilme que recobre o epitélio, observando que no intestino delgado, aderência ao muco deve ter um importante papel na colonização bacteriana. NATARO e cols. (1996) declararam que a produção aumentada de muco parece estabelecer um círculo vicioso de aderência a esta substância e aumento de sua produção, o que leva à formação de um espesso biofilme sobre a mucosa. Este biofilme poderia também atuar como barreira à absorção de nutrientes, contribuindo na patogênese da diarréia persistente.

As bactérias formaram agregados típicos em "pilhas de tijolos" nas duas regiões estudadas. Apesar de não ter sido realizada avaliação quantitativa, não foram observadas diferenças de cepa para cepa. YAMAMOTO e cols. (1991), fazendo avaliação quantitativa com 1 cepa de EAEC, encontraram resultados muito similares em termos de aderência para cada fragmento intestinal, humano ou animal, avaliado. Outro estudo com mucosa pre fixada de jejuno, íleo e cólon, mostrou variações entre as cepas avaliadas. Cinco das seis cepas de EAEC estudadas mostraram maior afinidade a jejuno que a íleo e cólon. A avaliação demonstrou variações de cepa para cepa e entre os fragmentos avaliados (HICKS e cols, 1996A). Posteriormente, estes mesmos autores concluiram que estas bactérias podem aderir ao jejuno, ao íleo, e ao cólon, sendo que neste estudo, as análises quantitativas mostraram maior número de bactérias aderidas ao intestino grosso (HICKS e cols, 1996B). Neste trabalho, todas as cepas aderiram às duas regiões, íleo e cólon, com maior afinidade a camada de muco que recobria o epitélio e aparentemente na mesma intensidade, sem variações individuais.

Vários estudos enfatizaram a associação destes agentes à mucosa colônica (YAMAMOTO e cols., 1991; KNUTTON e cols., 1992), no entanto outros procuraram demonstrar sua afinidade à mucosa de intestino delgado, afim de justificar sua função na gênese da diarréia persistente (HICKS e cols., 1996A). RAJ e cols. (1990) já haviam proposto esta afinidade, trabalhando com enterócitos isolados de duodeno. Por outro lado, no estudo de KNUTTON e cols. (1992) nenhuma das cepas avaliadas aderiu à mucosa duodenal humana. HICKS e cols. (1996B e 1996C) observaram aderência à mucosa jejunal, ileal e colônica, mas somente conseguiram demonstrar alterações morfológicas no íleo e no cólon. Em modelo animal, alterações morfológicas foram mais significativas no intestino delgado distal que no proximal (TICKOO e cols., 1992, TZIPORI e cols., 1992).

Nesta pesquisa, não foram avaliados duodeno e jejuno. Isto se deveu ao fato de que, na literatura, não foram descritas modificações provocadas por estes agentes, que pudessem levar a evolução para diarréia persistente, nestas regiões do trato digestivo. Foram portanto empregados neste estudo, fragmentos de íleo e de cólon.

No cólon, foram observadas alterações morfológicas que justificariam a presença de muco e sangue nas fezes de pacientes com diarréia persistente infectados por EAEC. Diarréia sanguinolenta associada a estes enteropatógenos tem sido relatada (BHAN e cols., 1989D; CRAVIOTO e cols., 1991; HAIDER e cols., 1991). Por ML, para todas as cepas avaliadas, foram demonstradas bactérias aglomeradas em "pilhas de tijolos" na superfície epitelial, em meio a células inflamatórias e epiteliais (Figs. 5A, 5B, 5C, 6B e 6D). Nas regiões em que encontraram-se próximas ao epitélio, foi documentada grande quantidade de células caliciformes com áreas de lise, destruição e extrusão celular (Figs. 5, 5B, 5C e 5D) e áreas aonde as bactérias apareceram mais próximas das microvilosidades que pareceram alteradas (Fig.6B). Em grande parte do tecido, no entanto, foi vista a bordadura estriada preservada (Figs.: 4C e 6C). Por MET, foram demonstradas, nas regiões de proximidade das bactérias com o epitélio, microvilosidades em algumas regiões preservadas e em outras vesiculadas e arrancadas (Figs: 12A, 12B, 15C e 15D). HICKS e cols. (1996B) monstraram também por MET, áreas de vesiculação das microvilosidades, aonde as bactérias apareceram em proximidade com o epitélio.

As diferentes cepas provocaram alterações morfológicas distintas. A cepa 042 e a 71-1 mostraram formação de vacúolos na base dos enterócitos, estruturas estas, que ao atingirem certo tamanho romperam-se parecendo provocar o despregamento do epitélio, o que foi documentado por ML (Figs. 4A, 4C, 4D e 6A) e por MET (Figs.: 14A e 15B). As demais cepas mostraram alterações tipo lise epitelial e extrusão celular, mas não a vacuolização observada nas cepas 042 e 71-1 (Figs. 5A, 5B, 5C, 5D, 12A e 12B). Esta vacuolização talvez seja devida a alguma toxina liberada por estas cepas. NATARO e cols. (1996) avaliando a cepa 042 com a linhagem celular T84 demonstraram vesiculação do ápice da borda em escova, em algumas células resultando em ausência de microvilosidades e alterações do citoplasma, com a região apical hipodensa e desprovida de organelas e a baso-lateral com áreas de vacuolização. Com tecido humano em cultura de orgão "in vitro", foram observadas aderência ao cólon, com dilatação e abertura das criptas, aparecimento de fendas intercrípticas e exfoliação de enterócitos.

A única alteração demonstrada nos controles negativos, foi extrusão celular em alguns experimentos, o que poderia estar relacionado à alta taxa de renovação celular que se observa em regiões contaminadas do trato digestivo, embora também pudesse ter ocorrido em consequência do procedimento "in vitro".

Sugestão de internalização bacteriana foi demonstrada com as cepas 042 e 171-1. Nos fragmentos de cólon infectados e alterados, a MET revelou bactérias no tecido conjuntivo em proximidade a fibras de colágeno (Figs.: 13B, 13C e 14B). As bactérias teriam invadido o tecido pelas áreas de destruição epitelial que provavelmente ocorreu devido à ação de alguma toxina produzida pela bactéria. A cepa 171-1 foi mostrada aparentemente penetrando no tecido através da região que une o enterócito e uma célula caliciforme (Figs.12A e 12B). Em áreas onde foi observada extrusão celular, foram documentadas bactérias envolvidas por vacúolos, dentro do citoplasma da célula que aparece na luz intestinal (Fig.13A).

Nos fragmentos de íleo contaminados pela cepa 171-1, foi demonstrada destruição da superfície epitelial (sugestão de ação citotóxica), tanto por ML quanto por MET (Figs. 9 e 17). A cepa 171-1 mostrou-se invadindo o tecido que apresentou-se totalmente desagregado e desprovido de epitélio (Fig. 9). Não foi encontrado na literatura, nenhum relato com lesões desta magnitude. Estas alterações ocorreram em um período máximo de 6 horas de incubação dos fragmentos com as cepas de EAEC. Será necessária a realização de um estudo da cinética bacteriana para uma avaliação mais precisa da ocorrência destes fenômenos.

Também no íleo, a cepa 042, com os mesmos períodos de experimento, demonstrou alterações aparentemente menos intensas, mas também significativas. Por ML, foram demonstradas áreas de despregamento e arrancamento do epitélio (Figs.10A, 10B, 10C e 10D). Por MET, foram documentadas áreas em que a bordadura estriada apareceu preservada e outras em que apareceu vesiculada (Figs.18A e 18B). Foi observado também que a destruição tecidual observada nesta região do trato digestivo pareceu ter seguido o mesmo padrão das lesões documentadas no cólon em relação à cepa avaliada. A cepa 042 formou os mesmos vacúolos na região basal dos enterócitos, vacúolos estes que levaram ao despregamento e arrancamento da superfície epitelial (Fig. 18A). Foram mostradas regiões em que os vacúolos ainda pareciam pequenos com conteúdo homogêneo e regiões em que apareciam dilatados e rompidos e, nestas áreas do tecido foram vistas bactérias internalizadas (Figs. 18A, 18B, 18C e 18D). A vacuolização da região basal dos enterócitos, levando ao despregamento do epitélio, foi observada também nesta região. Por outro lado, a cepa 171-1 provocou lise da superfície epitelial e aparentemente por isto, permitiu a internalização do agente bacteriano. Esta variabilidade entre as cepas pode ser devida a heterogeneidade destes agentes já referida anteriormente (OKEKE e cols., 2000; SUZART e cols., 2000).

Invasão primária por cepas de EAEC foi demonstrada por MET, apenas uma vez na literatura (BENJAMIN e cols., 1995). Estes autores demonstraram que uma grande porcentagem de cepas de EAEC provenientes de várias regiões geográficas foram internalizadas em ensaios com células HeLa. A cepa 162 também foi analisada em ensaios com células T84 e HT29, tendo sido observada invasão nestes procedimentos. Este fato e a observação de que as bactérias se dividiam após a internalização foram sugestivos de que a invasão não seria um mero fenômeno.

Alguns autores já haviam comentado que o que é demonstrado "in vitro" não deve ser o mesmo observado "in vivo", uma vez que nos modelos "in vitro", os fragmentos intestinais ficam expostos a grandes concentrações bacterianas, sem os efeitos de diluição das secreções gástricas e intestinais que devem atuar "in vivo" (HICKS e cols.; 1996B). VIAL e cols. 1988, foram os primeiros a demonstrar lesões citotóxicas em infecção experimental de alças ligadas de coelhos e ratos “in vivo” com amostras de EAEC. A ML da mucosa ileal, revelou achatamento das vilosidades, necrose hemorrágica do topo das vilosidades e resposta inflamatória leve, com edema e infiltrado mononuclear da submucosa. Os autores demonstraram, por ML, regiões aonde o tecido conectivo apresentou-se desnudado pela falta da superfície epitelial (VIAL e cols., 1988). Outros estudos "in vivo" mostraram alterações menos significativas (TICKOO e cols., 1992; TZIPORI e cols., 1992). A análise da mucosa intestinal de coelhos infectados com amostras de EAEC mostrou achatamento moderado das vilosidades com fragmentação nuclear, sendo que estas modificações foram mais significativas no intestino delgado distal que no proximal (TICKOO e cols., 1992). TZIPORI e cols. (1992) observaram edema das vilosidades do intestino delgado, em suínos gnotobióticos que haviam recebido amostras de EAEC por via oral. HICKS e cols. (1996C) demonstraram "in vitro", alterações como extrusão celular em fragmentos de íleo infectados por EAEC, mas não revelaram lesões citotóxicas como as encontradas nesta avaliação. Estes autores não demonstraram alteração nas microvilosidades.

As lesões observadas tanto em fragmentos de íleo quanto em fragmentos de cólon, poderiam ser devidas a artefactos de técnica, mas não foram observadas nos controles. Aparentemente ocorreram lesões nos controles negativos que foram mais proeminentes em fragmentos de cólon que de íleo quando em comparação com os controles diretos, mas quando comparado com as observadas nos fragmentos infectados, estas pareceram ser discretas. Por MET, foi demonstrada vacuolização do citoplasma em algumas regiões do cólon controle negativo, mas estes vacúolos não se apresentaram da mesma maneira que os observados com as cepas 042 e 71-1 e não levaram ao descolamento do epitélio visto nos fragmentos de cólon infectados com estas cepas. Estes vacúolos, diferentemente dos observados nos fragmentos infectados, não foram observados em todos os fragmentos. Foram observadas vesiculação de microvilosidades especialmente nos controles negativos. Estas alterações poderiam estar relacionadas com o experimento, que por manter o tecido por 6 horas sem vascularização, acabaria por levar a lesões em algumas regiões do tecido.

Quanto ao íleo, não foram demonstradas alterações significativas quando comparados os controles negativos com os controles diretos. Os controles de mucosa ileal não mostraram as mesmas alterações encontradas nos fragmentos infectados. Por ML, foram demonstradas no controle negativo, vilosidades aparentemente encurtadas, talvez pelo fato da região distal do intestino delgado, pela proximidade com o intestino grosso, contaminado, apresentar maior velocidade de renovação celular. Sabe-se que variados graus de atrofia vilositária são encontrados em indivíduos assintomáticos residentes em países em desenvolvimento (FAGUNDES-NETO, 1996).

As bactérias avaliadas provocaram lesões significativas nas duas regiões avaliadas. As lesões observadas no íleo pareceram mais intensas que as observadas no cólon, talvez pelo fato de as vilosidades serem mais proeminentes no íleo, o que poderia facilitar o despregamento do córion, predispondo a lesões significativas em menor espaço de tempo.

Aparentemente, a perpetuação do processo diarréico estaria relacionada ao desarranjo provocado no íleo, levando às deficiências enzimáticas com consequente má absorção de nutrientes a que estas alterações estruturais predisporiam. A produção excessiva de muco estimulada pela presença destas bactérias levaria à formação de um espesso biofilme que também poderia alterar a absorção dos nutrientes, agindo como uma barreira ao contacto dos nutrientes com a mucosa. Lesões no intestino delgado predisporiam o paciente à penetração de antígenos por esta região, levando ao desenvolvimento de intolerâncias alimentares que perpetuariam a lesão e consequentemente o processo diarréico.

KAPER & NATARO (1988) propuseram um modelo para a patogênese das EAEC, em três estágios, a saber: No primeiro estágio, ocorreria a adesão da bactéria à mucosa intestinal e/ou à camada de muco. As fímbrias seriam os principais candidatos a facilitadores desta colonização inicial. O segundo estágio envolveria a produção aumentada de muco, levando à formação de um biofilme, onde as bactérias ficariam aderidas. A camada de muco poderia ser responsabilizada pela colonização persistente da bactéria e talvez pela má absorção de nutrientes. Num terceiro estágio, haveria a produção de citotoxinas que provocariam danos às células intestinais. Os autores sugeriram também, a possibilidade de que hospedeiros desnutridos fossem particularmente prejudicados em sua capacidade de recuperação dos danos causados pela bactéria e por isso, mais predispostos ao prolongamento do processo diarréico (NATARO & KAPER, 1998).

Alguns estudos confirmaram que estes organismos produzem substâncias mucolíticas que permitiriam o encravamento destas bactérias no biofilme de muco que recobre a mucosa após a colonização bacteriana. HENDERSON e cols. (1999) denominaram esta proteína, uma serino protease extracelular, Pic (proteína envolvida na colonização intestinal). Estes autores sugeriram que Pic teria funções mucolítica, de resistência à morte mediada por complemento e de hemaglutinação, que seriam relevantes na colonização dos intestinos. Eles não conseguiram demonstrar uma ação citotóxica para esta substância. Todas as cepas avaliadas hibridaram com a sonda she para esta toxina, exceto a cepa 171-1 (TABELA 2).. É provável que a cepa 171-1 utilize outras substâncias para colonizar o muco, uma vez que, em fragmentos de cólon, foi encontrada em aglomerados próximos ao epitélio e longe dele, em meio a células inflamatórias na camada de muco (Fig. 5).

Uma outra toxina, denominada Pet (toxina codificada por um plasmídeo) provocou danos citopáticos e enterotóxicos em células HEp-2 e HT29 (NAVARRO-GARCIA e cols., 1999). Exceto a cepa 042, nenhuma das cepas deste estudo hibridou com a sonda para Pet (TABELA 2). Além disto, nenhuma das cepas deste estudo hibridou com a sonda hly que codifica (-hemolisina. Estas cepas devem, portanto, utilizar outros meios para provocar as lesões demonstradas nas regiões do trato digestivo avaliadas. Inicialmente, colonizariam estas regiões do aparelho digestivo e manteriam-se aderidas umas à outras devido a sua capacidade de produzir adesinas fimbriais e não fimbriais. Algumas destas fímbrias atuariam estimulando a produção de muco aonde elas ficariam aderidas, iniciando com isto, um círculo vicioso. À partir daí, esta afinidade ao muco seria mantida através da produção de certas substâncias já descritas (Pic ou outras), que permitiriam sua penetração pelo espesso biofilme e consequente aproximação da superfície epitelial. No muco, produziriam outras substâncias que permitiriam sua permanência no local e aproximação ao epitélio e em contacto com este, toxinas que atuariam promovendo secreção intestinal ou alterações citotóxicas. Estas substâncias levariam à destruição tecidual por mecanismos diversos, ou por lise celular, ou por vacuolização da base dos enterócitos. A destruição, o descolamento e o arrancamento da superfície epitelial levariam a danos à absorção quando no intestino delgado, além de penetração de antígenos, que seria fator perpetuador do processo. Em ambas as regiões, poderia ocorrer internalização bacteriana e com isto potencialização dos danos provocados. No cólon, as lesões levariam a eliminação de fezes com muco e sangue.

Várias toxinas tem sido descritas, entre elas, EAST1, que provocaria diarréia secretora muitas vezes relatada em pacientes em que estes agentes foram encontrados nas fezes (BHAN e cols., 1989C; PAUL e cols.; 1994). Sabe-se, no entanto que EAST1 é encontrada tanto em cepas patogênicas, quanto em cepas não patogênicas de EAEC, além de em outros agentes enteropatogênicos (SAVARINO e cols., 1996). Neste estudo, somente as cepas 042 e a extraída de paciente sem diarréia hibridaram com a sonda astA que codifica a toxina EAST-1.

Mais recentemente, foi identificada uma proteína flagelar que interage com células epiteliais, levando à secreção de IL-8 e ao recrutamento de neutrófilos para a superfície epitelial e com isto, potencializando os efeitos de outras toxinas (STEINER e cols., 2000). Paralelamente a estas toxinas descritas, outras também vem demonstrando capacidade tanto de promover diarréia secretora quanto de levar à morte celular e suas consequências (BALDWIN e cols., 1992).

Os vários fatores de virulência identificados nestes microorganismos e outros, ainda não descritos, atuariam portanto em conjunto, permitindo a colonização do trato gastrointestinal e consequentemente, os mecanismos que seriam responsáveis pela síndrome de má absorção encontrada no processo diarréico.

O processo diarréico prolongado com suas consequências somente é controlado com a adoção de medidas terapêuticas específicas como a retirada de elementos agressores da dieta, introdução de hidrolisados proteicos e até mesmo, dependendo do grau de lesão intestinal, uso de nutrição parenteral, total ou parcial, até a eliminação do agente agressor, a restituição da integridade da mucosa e consequente recuperação clínica e nutricional. Levando-se em consideração os riscos que a diarréia persistente envolve, é muito importante que sejam estabelecidas estratégias de prevenção. E a estratégia mais eficaz para isto é o incentivo ao aleitamento materno exclusivo (HOWIE e cols., 1990). Recentemente, componentes do leite humano inibiram a aderência de uma cepa de EAEC isolada de uma criança com diarréia em São Paulo, Brasil, a células HeLa (NASCIMENTO DE ARAUJO & GIULIANO; 2000), indicando que o leite humano poderia proteger lactentes destes enteropatógenos.

6. CONCLUSÕES

Quanto ao sítio de colonização, as amostras estudadas colonizaram tanto intestino delgado quanto grosso.

As amostras apresentaram adesão à camada de muco que recobria a superfície da mucosa intestinal nas duas regiões avaliadas.

Foram observadas à ML e à MET, alterações histopatológicas com desarranjo estrutural aparentemente significativo, nas regiões do cólon e do íleo infectadas.

À MEV, as bactérias mostraram estruturas fimbriais em sua superfície que parecem mediar a adesão de umas às outras e ao muco.

A cepa RN 190/2, isolada de criança sem diarréia, mostrou padrão AA nas regiões do íleo e cólon avaliadas. Esta cepa mostrou-se aderida diretamente ao epitélio e também ao muco. Isto sugere que a manifestação clínica possa estar relacionada com a presença de receptores específicos que permitiriam a colonização destes agentes no intestino ou à presença de mecanismos de defesa do hospedeiro que pudessem depurar o organismo do agente.

Por MEV, não foram observadas diferenças quanto ao sítio de adesão entre as cepas avaliadas que aderiram aparentemente com a mesma afinidade a ambas as regiões do trato digestivo e sem diferenças individuais.

Todos os fragmentos infectados por amostras de EAEC apresentaram maior quantidade de muco quando comparados com os controles direto e negativo. Este achado sugere uma capacidade de estimular a produção de muco pela mucosa intestinal infectada já relatada na literatura.

Os fragmentos infectados com cepas de EAEC mostraram alterações citotóxicas intensas, o que não foi encontrado nos fragmentos controle tanto direto quanto negativo.

As alterações histopatológicas observadas à ML, foram mais significativas no íleo que no cólon. A perpetuação do processo diarréico está provavelmente relacionada ao desarranjo provocado nesta região do intestino delgado.

O achado de amostras de EAEC no cólon causando alterações morfológicas de variado grau de intensidade justificaria a descrição de diarréia sanguinolenta frequentemente relatada na literatura.

Evidência de extrusão celular foi encontrada em alguns fragmentos de colón não infectado (controle negativo), mas as alterações descritas nos fragmentos infectados pelas cepas de EAEC foram significativamente mais intensas, com áreas de descolamento do epitélio, além das áreas de extrusão celular.

As alterações na mucosa colônica justificariam a presença de muco e sangue nas fezes, mas não seriam por si só responsáveis pela perpetuação do processo.

A colonização tanto do íleo quanto do cólon poderia estar relacionada a afinidade destas bactérias a material mucoso e a sua capacidade de colonizar o epitélio. No íleo, isto resultaria na perpetuação do processo diarréico, com diarréia secretora inicialmente e desnutrição por distúrbios das funções digestiva e absortiva como consequência.

Foi possível documentar regiões aonde as bactérias aparecem em aglomerados típicos sobre a camada de muco longe do epitélio e ao mesmo tempo em proximidade com a bordadura estriada.

Por ML, as microvilosidades pareceram estar alteradas em algumas regiões aonde foi possível documentá-las próximas ao epitélio. Por MET, as microvilosidades apareceram preservadas em algumas regiões e vesiculadas e arrancadas em outras.

As cepas pareceram usar diferentes mecanismos para provocar lesões na mucosa intestinal confirmando com isto, a heterogeneidade destes agentes.

Tanto à ML quanto à MET foi possível documentar a internalização destes agentes em fragmentos de cólon e de íleo.

Sugestão de invasão secundária parece ser mais um mecanismo de virulência nesta categoria de Escherichia coli.

7. ANEXOS

7.1. ANEXO 1

UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Estamos realizando estudo com mucosa de intestino humano, no qual necessitamos coletar amostras deste tipo de tecido. O estudo tem como objetivo avaliar o modo de ação de um determinado grupo de bactérias e com isto, esclarecer uma série de dúvidas relacionadas à diarréia em crianças.

Para a coleta deste material, estamos escolhendo adultos e crianças para as quais já estão indicados procedimentos endoscópicos.

Durante a endoscopia são normalmente coletadas biópsias. Estamos solicitando autorização para a retirada de 3 fragmentos a mais, os quais seriam utilizados neste trabalho. Os riscos da coleta deste material são os mesmos apresentados pela equipe da Endoscopia a qual somente é realizada quando é dada autorização para o procedimento pelo paciente ou responsável.

Esta autorização não implicará em nenhum custo para o paciente. O paciente estará totalmente assistido durante o procedimento.

O paciente ou o responsável tem liberdade para não permitir a retirada dos fragmentos.

Nós, abaixo assinados assumimos total responsabilidade sobre qualquer dano que venha ocorrer ao paciente em decorrência da retirada destes fragmentos acima mencionados

____________________

São Paulo, ___/___/_____

7.2. ANEXO 2

UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO

Estamos realizando estudo com mucosa de intestino humano, no qual necessitamos coletar amostras deste tipo de tecido. O estudo tem como objetivo avaliar o modo de ação de um determinado grupo de bactérias e com isto esclarecer uma série de dúvidas relacionadas à diarréia em crianças. Para a coleta deste material, estamos escolhendo crianças para as quais já estão indicados procedimentos cirúrgicos de ressecção intestinal.

Durante o procedimento cirúrgico de ressecção intestinal é retirada uma alça intestinal que em geral apresenta problemas, que são o motivo pelo qual a cirurgia está indicada. Estamos solicitando autorização para retirar, do bordo da alça ressecada, parte de material para uso em nosso estudo. A coleta deste material não acarretará riscos adicionais para o paciente, uma vez que a ressecção desta alça intestinal está indicada pela equipe de cirurgia pediátrica.

Esta autorização não implicará em nenhum custo para o paciente.

O paciente estará totalmente assistido durante o procedimento. O responsável pelo paciente tem liberdade para não permitir a coleta deste material.

Nós, abaixo assinados assumimos total responsabilidade sobre qualquer dano que venha ocorrer ao paciente em decorrência deste procedimento.

____________________

São Paulo, ___/___/_____

7.3. ANEXO 3

UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo

TERMO DE CONSENTIMENTO

Eu,____________________________________________________________, abaixo-assinado, responsável pelo menor ___________________________________________________________, autorizo a coleta de fragmentos de mucosa intestinal, durante procedimento cirúrgico, para uso em projeto de pesquisa.

______________________

São Paulo, ___/___/_____

7.4. ANEXO 4

UNIFESP - Universidade Federal de São Paulo

TERMO DE CONSENTIMENTO

Eu,________________________________________________, abaixo-assinado, autorizo a coleta de fragmentos de mucosa intestinal, durante procedimento endoscópico, para uso em projeto de pesquisa.

____________________

São Paulo, ___/___/_____

7.5. ANEXO 5

7.5.1.  Meios de cultura, reagentes e soluções utilizados

7.5.1.1 Para o cultivo e manutenção das amostras de EAEC

7.5.1.1.1.  Caldo triptona de soja - TSB

Após rehidratação, o soluto foi dissolvido por aquecimento, distribuído em tubos de 12 X 120 mm (3 ml por tubo) e esterilizado em autoclave a 121ºC por 15 minutos. Até o momento do uso, o meio, utilizado para cultivo das cepas bacterianas, foi armazenado a 4ºC.

Ágar nutriente.

Os componentes químicos foram dissolvidos em água destilada e aquecidos para formar uma solução. À seguir, foram misturados e distribuídos em tubos tipo estoque (3 ml por tubo), que foram então, esterilizados a 121ºC por 15 minutos. O TSB foi utilizado para manutenção das amostras em temperatura ambiente.

7.5.1.2.  Para os testes de interação de amostras de EAEC com células da mucosa intestinal humana preservada “in vitro”

7.5.1.2.1.  Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco-Vogt (PBS-D & V) pH 7.4 (DULBECCO & VOGT, 1954)

Os sais (MERCK) foram dissolvidos em água bidestilada. A solução esterilizada por autoclave a 121ºC por 20 minutos foi armazenada a temperatura ambiente.

O PBS D & V foi utilizado nos testes de adesão, durante as etapas de lavagem dos fragmentos intestinais.

7.5.1.2.2.  Meio NCTC 135 pH 7,4

O meio NCTC 135 (SIGMA) acrescido de 2 mM de L-glutamina (SIGMA) foi preparado, esterilizado e armazenado a 4ºC até o momento do uso. Este meio foi utilizado na elaboração do meio de cultivo de orgão modificado.

7.5.1.2.3.   Meio de Trowell T8 (MTT8) pH 7,4

O MTT8 (FLOW) foi adquirido em forma líquida e esterilizado. O meio foi armazenado a 4ºC até o preparo do meio de cultivo de orgão modificado.

7.5.1.2.4.  Meio de cultivo de orgão modificado  pH 7,4 (MCOM)

O MCOM foi adaptado à partir do meio de cultivo de orgão descrito por EMBAYE e cols. (EMBAYE e cols., 1989) e foi constituído da seguinte mistura:

Este meio foi armazenado a 4ºC e empregado no estudo da interação das bactérias com células de mucosa intestinal humana preservada.

7.5.1.3.  Para processamento de células de mucosa intestinal humana preservada para visualização através de ML

7.5.1.3.1.  Solução de estoque de tampão Cacodilato de sódio -HCl 0,2M pH 7,4 (Tampão cacodilato de sódio a 0,2M)

Solução A

Solução B

Para obtenção do tampão na concentração de 0,2M e pH 7,4 foram misturados volumes de 40,5 ml da solução A com 9,5 ml da solução B, sendo a mistura final diluída em 1:2 (v/v) em água bidestilada, para obter o tampão na concentração de 0,1M e 200mOsm. As soluções A e B e a mistura final foram armazenadas a 4ºC até o momento do uso. Este tampão foi utilizado na última etapa de lavagem, nos estudos de interação das bactérias com células de mucosa intestinal humana preservada e durante o processamento do material para microscopia (MET e MEV).

7.5.1.3.2.  Solução tamponada de paraformaldeído (PFA)

Para obtenção da solução tamponada de paraformaldeído, volume de 45 ml de tampão cacodilato de sódio-HCl 0,2M pH 7,4 foi aquecido a 70ºC. No início do aquecimento, foi adicionado 2,5g de paraformaldeído seguido de agitação contínua. Como a solução permaneceu turva foram adicionadas gotas de NaOH 0,2M aos poucos até a solução atingir pH 7,0. Após o resfriamento, foi completado o volume para 50 ml e a solução resultante, armazenada a 4ºC. Esta solução foi utilizada na fixação de fragmentos intestinais humanos para cortes histológicos.

7.5.1.3.3.  Resina Historesin (LKB 2218-500)

O kit Historesin é composto por soluções de infiltração e inclusão e foi utilizado de acordo com as especificações do fabricante. O kit foi usado na elaboração de blocos para cortes histológicos de fragmentos intestinais humanos.

7.5.1.3.4.  Solução de azul de toluidina a 0,1%

O corante foi dissolvido em água bidestilada estéril e filtrado em papel filtro. A solução foi armazenada em frasco escuro à temperatura ambiente e usada para corar cortes histológicos de fragmentos intestinais humanos.

7.5.1.3.5.  Solução de fucsina básica a 0,1%

O corante foi dissolvido em água bidestilada estéril e filtrado em papel filtro. A solução foi armazenada em frasco escuro à temperatura ambiente e usada para corar cortes histológicos de fragmentos intestinais humanos.

7.5.1.4.  Para processamento de células de mucosa intestinal humana preservada para visualização através de MET e MEV

7.5.1.4.1 Karnovsky modificado (Km)

A solução foi preparada, aliquotada em pequenos volumes e armazenada a -20ºC até o momento do uso. O Km foi usado para fixar os fragmentos intestinais humanos após os testes de interação com as bactérias.

7.5.1.4.2.  Solução estoque de tetróxido de ósmio a 4% (OsO4)

A ampola contendo 1 g de OsO4 cristalizado foi lavada com água e sabão e exaustivamente enxaguada em água destilada. À seguir foi seca e colocada em um frasco escuro contendo 25 ml de água destilada para em seguida ser quebrada com um bastão de vidro. O frasco então foi rapidamente tampado e vedado com esparadrapo. Este frasco foi colocado dentro de outro frasco que também foi vedado. Ficou dentro da capela em temperatura ambiente por uma noite para que dissolvesse por completo. A solução estoque foi então armazenada a 4ºC e no momento do uso, volume adequado de solução estoque foi diluído a 1% com solução tampão cacodilato de sódio a 0,1M (ítem 7.5.1.3.1).

A solução de OsO4 a 1% foi utilizada para a pós-fixação dos materiais, efetuada na ausência de luz.

7.5.1.4.3.  Solução de acetato de uranila a 0,5%

A solução foi preparada e armazenada a 4ºC até o momento do uso. Esta solução foi usada na contrastação do material após fixação com tetróxido de ósmio.

7.5.1.4.4.  Resina Araldite (EMS)

A resina Araldite foi usada para emblocar os fragmentos intestinais humanos para posteriormente serem feitos os cortes ultra-finos.

7.5.1.4.5.  Solução de acetato de uranila a 2 %

O corante foi dissolvido em água, filtrado em papel tipo filtro e armazenado em frasco escuro a 4ºC. A solução de acetato de uranila foi utilizada para corar os cortes ultra-finos das preparações dos fragmentos intestinais humanos emblocados em araldite. (ítem 7.5.1.4.4.).

7.5.1.4.6.  Solução de citrato de chumbo a 0,88%

Os solutos foram dissolvidos em aproximadamente 100 ml de água bidestilada previamente fervida e tratada com 0,4 g de NaOH. Após a dissolução, a solução foi colocada em um balão de vidro e o volume completado para 192 ml de água. Se a solução ainda permanecesse turva, era colocado volume de aproximadamente 8 ml de NaOH, sob agitação, até que a solução final ficasse totalmente transparente.

A solução de citrato de chumbo foi utilizada para corar os cortes ultra-finos das preparações dos fragmentos intestinais humanos emblocados em araldite.

7.6. ANEXO 6

APROVAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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June 2006 Volume 10 Number 2 

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